Etude du rôle des régulateurs Post-transcriptionnels Pumilio dans les cellules souches hématopoïétiques humaines

Study of the role of Pumilio post-transcriptional regulators in human hematopoietic stem cells

• Auteur / Autrice : Ayda Miri Nezhad
• Direction : Serge Fichelson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 25/03/2013
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie et biotechnologie (Paris ; 1997-2014)
• Jury : Président / Présidente : Claire Francastel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Serge Fichelson, Claire Francastel, Vincent Praloran, François Morlé, Thierry Jaffredo, Olivier Hermine
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Praloran, François Morlé

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines de Drosophila

physiologie

Cellules souches hématopoïétiques

Biologie cellulaire

immunologie

Éléments de régulation transcriptionnelle

Thérapie génique

Hématopoïèse

Croissance

Cellules souches hématopoïétiques

Thérapeutique

Sang -- Maladies

Mots clés libres

Cellules souches hématopoïétiques humaines

Hématopoïèse

Facteurs Pumilio

Human hematopoietic stem cells

Hematopoiesis

Pumilio factors

Résumé

Des mises au point de nouvelles stratégies d’expansion ex vivo des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont développées depuis quelques années afin de pallier le problème du faible nombre de ces cellules pour le traitement des hémopathies ou de certaines tumeurs solides. Notre équipe avait établi un modèle d’expansion des CSH via leur exposition aux homéoprotéines HOXB4 ou HOXC4. L’étude comparative des transcriptomes de ces cellules a permis l’identification de cibles précoces des facteurs HOXB4/C4 parmi lesquels les gènes codant les régulateurs post-transcriptionnels Pumilio (de la famille PUF). Les facteurs PUF sont impliqués en particulier dans le maintien des cellules souches germinales dans différents modèles animaux, chez les vertébrés ou les invertébrés. Cependant, le rôle des facteurs PUF humains (hPum1 et hPum2) dans les cellules hématopoïétiques humaines n’avait jamais été étudié.Mon travail de thèse exposé ici a consisté, d’une part, en l’étude du profil d’expression des facteurs hPum1 et hPum2 dans différentes lignées hématopoïétiques et au cours de l’hématopoïèse humaine, démontrant une expression plus importante de ces gènes dans les cellules les plus immatures ainsi que dans les progéniteurs dont la prolifération est activée. D’autre part, l’étude fonctionnelle des facteurs hPum1 et hPum2 a mis en évidence leur implication dans l’expansion et la survie des cellules CD34+. L’inhibition spécifique de hPum1 ou de hPum2 in vitro par des shARN, induit une diminution significative du nombre absolu des cellules ainsi qu’une augmentation de leur apoptose. Cela corrèle avec une accumulation des CSH en phase G0-G1 du cycle cellulaire. Par ailleurs, la répression de l’expression de hPum1 ou de hPum2 diminue la reconstitution de l’hématopoïèse in vivo dans des souris immunodéficientes NOD-SCID-γC-/-. L’analyse des ARNm cibles des facteurs Pum par une étude comparative des transcriptomes des CSH transduites ou non par des vecteurs lentiviraux contenant des shARN hPum1 ou hPum2, a permis l’identification de nombreux gènes impliqués dans le contrôle de la croissance, de la survie ou du cycle cellulaire. L’ensemble de nos résultats montre l’indispensable implication des facteurs Pumilio dans le maintien de l’état souche, la prolifération et la survie des CSH humaines. Nous avons démarré des études fonctionnelles dans les cellules leucémiques myéloïdes primaires afin d’évaluer le rôle éventuel des facteurs Pumilio dans la leucémogenèse. Ultérieurement, la caractérisation de hPum1 et hPum2 comme de nouvelles molécules impliquées dans l’expansion des CSH permettra d’envisager leur étude dans la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells (HSCs) could improve new therapeutic strategies for the treatment of hematopoietic malignancies and solid tumors. Our team had developed an original method to expand human HSCs, consisting in the transfer into these cells of active HOXB4 or HOXC4 homeoproteins. The comparative transcriptomic analysis of CD34+ cells exposed or not to HOXB4 or HOXC4 proteins induced over-expression of Pumilio (PUF) genes. PUF proteins are post-transcriptional regulators of gene expression. They are involved in different biological functions among which the maintenance of stem cells. However, the function of human PUF factors (hPum1 and hPum2) in hematopoietic stem cells has never been investigated. The work that I developed during my thesis first consisted in analyzing the expression of PUF factors in different hematopoietic cell lines and during human hematopoiesis. The results highlighted a high expression of the hPum1 en hPum2 genes in the most immature cells and in the proliferating active progenitors. The study of human PUF factors by inducing their inhibition using specific shRNAs revealed their involvement in proliferation and survival of CD34+ cells. In vitro, inhibition of hPum1 or hPum2 decreases the expansion of human HSCs and increases cell apoptosis. The hPum1 or hPum2 repression also increases the number of HSCs in G0-G1 phase of the cell cycle. Moreover, the inhibition of hPum1 or hPum2 reduces the capacity of human HSCs to reconstitute in vivo hematopoiesis of immunodeficient NOD-SCID-γC-/- mice. The identification of PUF target mRNAs by a comparative transcriptomic analysis of human HSCs infected or not with lentiviral vectors containing hPum1/2 shRNAs, revealed a large number of genes involved in the regulation of cell growth, survival or cell cycle. On the whole, our results demonstrate the involvement of Pumilio factors in stemness maintenance, expansion and survival of human HSCs. Functional studies in primary myeloid leukemic cells are in progress to assess the potential role of the Pum factors in the leukemogenic process. Later on, identification of Pumilio factors as new regulators of HSCs expansion will allow consider them as new tools for therapeutic perspectives.