Conception de faux substrats fluorescents (FFS) dans le cadre de l’étude du transporteur vésiculaire de nucléotides et de la Sialine

Design of fluorescent false substrates (FFS) to study vesicular nucleotide transporter and Sialin

• Auteur / Autrice : Lilian Dubois
• Direction : Isabelle McCort
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie organique
• Date : Soutenance le 15/11/2013
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, environnement (Paris ; 2010-2013)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Chimie et de Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques
• Jury : Président / Présidente : Bruno Gasnier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle McCort, Bruno Gasnier, Jean-Marc Escudier, Didier Dubreuil, Franck Denat, Isabelle Gillaizeau, Nicolas Pietrancosta
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Marc Escudier, Didier Dubreuil

Mots clés

Mots clés contrôlés

Synthèse organique

Fluorescence

Protéines fluorescentes

Transport biologique

Nucléotides

Transport physiologique

Acides sialiques

Mots clés libres

Faux Substrat Fluorescent (FFS)

Faux Neurotransmetteur Fluorescent (FFN)

Transporteur Vésiculaire de Nucléotides (VNUT)

Sialine

Hétérocycle

O-Ribosylation

Fluorophore

False Fluorescent Substrate (FFS)

False Fluorescent Neurotransmitter (FFN)

Vesicular Nucleotide Transporter (VNUT)

Sialin

Heterocycle

O-Ribosylation

Fluorophore

Résumé

Le concept de composés appelés FFS, pour faux substrats fluorescents (ou FFN pour les neurotransmetteurs), a été introduit par le groupe du Dr Sames qui a conçu et optimisé des molécules fluorescentes reconnues comme substrats par le Transporteur Vésiculaire de Monoamine (VMAT2). Ces composés, une fois accumulés dans des vésicules synaptiques, ont permis la visualisation de l’activité neuronale monoaminergique en temps réel. Ce concept a servi d’hypothèse pour ce travail de thèse. En effet, nous avons conçu, synthétisé et évalué la potentialité de deux familles chimiques comme substrats fluorescents de transporteurs de la famille SLC17 : VNUT (transporteur vésiculaire de nucléotides) et la Sialine (transporteur d’acide sialique). Les molécules fluorescentes synthétisées devront être capables de remplacer/mimer les substrats naturels de VNUT et de la Sialine (respectivement l’ATP et le Neu-5-Ac) et de couvrir une large gamme de longueurs d’ondes d’émission pour nous adapter aux problématiques biologiques. L’élaboration de tels composés a été effectuée par conception rationnelle en synergie avec les résultats des tests d’inhibition et de transport et à partir de touches issues du criblage virtuel. Deux composés ont été plus particulièrement étudiés. D’une part, l’ATP a été modifiée en remplaçant le motif adénine par un fluorophore (éthéno, coumarines, quinoléines…). D’autre part, une touche virtuelle (Fmoc-Lys(Cbz)-OH) issue d’un vHTS sur la Sialine a été sélectionnée pour sa structure facilement modifiable, qui a permis l’incorporation aisée de motifs fluorescents. Une cinquantaine de composés a donc été synthétisée et évaluée pour leur capacité d’inhibition ou de substrat sur les cibles sélectionnées. Les résultats prometteurs de plusieurs composés en tant qu’inhibiteur laissent de nombreuses perspectives pour la compréhension de la machinerie vésiculaire.

The concept of compounds called FFSs for false fluorescent substrates (or FFNs for neurotransmitters) was introduced by the group of Dr Sames who designed and optimized fluorescent molecules recognized as substrates by the Vesicular Monoamine Transporter (VMAT2). Once accumulated in synaptic vesicules, these compounds have allowed visualization of the monoaminergic neuronal activity in real time. This concept has been used as hypothesis for this thesis work. Indeed, we have designed, synthesized and evaluated the potential of two chemical families as fluorescent substrates of SLC17 transporter family: VNUT (Vesicular Nucleotide Transporter) and Sialin (sialic acid transporter). The synthesized fluorescent molecules must be able to replace/mimic the natural substrates of VNUT and Sialin ( ATP and Neu-5-Ac, respectively) and to cover a wide range of emission wavelengths to deal with biological problems. The development of such compounds was performed by rational design in synergy with the results of inhibition and transport tests and by virtual screening. Two compounds have been specifically studied. On one hand, ATP was modified by replacing the adenine pattern by a fluorophore (etheno, coumarins, quinolines…). On the other hand, a virtual hit (Fmoc-Lys(Cbz)-OH), derived from vHTS targeted to Sialin, was selected for the ease to incorporate fluorescent patterns. Therefore, fifty compounds were synthesized and evaluated for their inhibitory or substrate ability on selected targets. The promising results of several compounds as inhibitors give rise to perspectives for understanding vesicular machinery.