La particule ribonucléoprotéique de l'élément L1 humain : spécificité de l'activité transcriptase inverse et partenaires cellulaires

The ribonucleoprotein complex of the human L1 element : specificity of the reverse transcriptase activity and cellular partners

• Auteur / Autrice : Clément Monot
• Direction : Gaël Cristofari
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 27/09/2013
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de recherche sur le cancer et le vieillissement (Nice)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gaël Cristofari, Oliver Weichenrieder, Christophe Terzian, Jean-Marc Vanacker, Pascal Barbry

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteurs nucléaires (biochimie)

Transcriptase inverse

Rétrotransposons

Mots clés libres

Rétrotransposition

Transcriptase inverse

Intégration

Récepteurs nucléaires

Ciblage chromatinien

Retrotransposition

Reverse transcriptase

Integration

Nuclear receptor

Targetting to chromatin

Résumé

Les éléments LINE-1 (L1) sont les seuls éléments transposables autonomes et actifs, constituant 20% de notre ADN. Ils prolifèrent via un intermédiaire ARN dans un processus appelé rétrotransposition. Les L1s encodent deux protéines, ORF1p et ORF2p, qui s’associent avec l’ARN du L1 pour former une particule ribonucléoprotéique (RNP), constituant l’intermédiaire fonctionnel de la rétrotransposition. Les L1s « sautent » activement dans les cellules germinales, les cellules souches embryonnaires et dans l’embryon précoce, conduisant occasionnellement à des maladies génétiques. Ils sont également exprimés et mobiles dans un certain nombre de cancers. Les sites d’intégration des L1s sont généralement considérés comme aléatoires, les déterminants moléculaires de leur insertion demeurant mal connus. Afin d’éclaircir ce processus, nous avons d’abord exploré les propriétés biochimiques des RNPs du L1, en mesurant leur activité transcriptase inverse in vitro sur une collection variée de substrats d’ADN. Nous avons observé que des substrats, qui diffèrent par leur séquence ou leur structure, ne sont pas tous utilisés efficacement par les RNPs du L1 pour amorcer la transcription inverse. Notre travail suggère que la spécificité et la flexibilité de l’initiation de la transcription inverse du L1 participe aux choix du site d’insertion. Dans un second temps, nous avons recherché des partenaires cellulaires de la RNP du L1 qui pourraient contribuer à la rétrotransposition et/ou la réguler, par des cribles double-hybride chez la levure. Nous avons découvert que la protéine ORF2p interagit avec un groupe de récepteurs nucléaires. Ces derniers possèdent un domaine de liaison à l’ADN qui reconnaît des séquences d’ADN spécifiques réparties dans le génome, et un domaine de liaison du ligand, qui permet d’activer la transcription des gènes cibles. Nos données suggèrent que ces facteurs participent à la rétrotransposition des L1s, possiblement en ciblant leurs RNPs dans certaines régions du génome. Dans leur ensemble, nos travaux ont contribué à améliorer notre compréhension de la relation entre éléments transposables et génome hôte, et de leur impact sur la plasticité du génome humain.

LINE-1 (L1) elements are mobile genetic elements, comprising up to 20% of the contemporary human genome, in which they are the only autonomously active element. They replicate through an RNA intermediate in a process named retrotransposition. Replication-competent L1 copies code for two proteins, ORF1p and ORF2p, that associate in cis with their own RNA to form a ribonucleoprotein complex (RNP), the functional intermediate of retrotransposition. L1s « jump » actively in germ cells, embryonic stem cells and in the early embryo, leading occasionally to genetic diseases. These elements are also expressed and mobile in a number of cancers. L1 insertion sites are generally considered as random. The molecular determinants of L1 insertion, as well as many steps of the retrotransposition cycle, remain uncertain. To get further insight in the molecular mechanisms of L1 retrotransposition, we first explored the biochemical properties of the L1 RNP, by measuring their reverse transcriptase activity in vitro on various DNA substrates. Using this approach, we observed that L1 RNPs do not equally extend DNA substrates, which differ in sequence or structure, to initiate cDNA synthesis. Our work suggests that the specificity and flexibility of L1 reverse transcription priming contribute to the choice of target sites. In a second approach, we performed yeast two-hybrid screens in order to discover cellular partners of the L1 RNP, which could contribute and/or regulate retrotransposition, We found that ORF2p interacts with a group of nuclear receptors. These proteins contain a DNA binding domain, which recognizes specific DNA sequences spread in the genome, and a ligand binding domain, driving transcriptional regulation of target genes. Our data suggest that these factors participate to L1 retrotransposition, potentially by tethering L1 RNPs to specific genomic regions. Altogether, this work has contributed to a better understanding of the relationship between mobile genetic elements and their host genome, and their impact on human genome plasticity.