L'étude des cellules vivantes et la dentine humaine par microscopie confocale Raman

par Hamideh Salehi

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Jacques-Henri Torres et de Christian Larroque.

Le jury était composé de Jacques-Henri Torres, Christian Larroque, Frédéric Cuisinier, Csilla Gergely, Shanti Rywkin, Thierry Cloitre.

Les rapporteurs étaient Guillaume Penel, Youri Arntz.


  • Résumé

    "L'étude des cellules vivantes et la dentine humaine par microscopie confocale Raman" La microscopie confocale Raman est utilisée pour suivre des médicaments et des nanoparticules dans les cellules et dans les tissus durs. La microscopie Raman est non-invasive, ne nécessite aucun marqueur et permet une imagerie à haute résolution. Dans la première partie de l'étude cette méthode est utilisée pour suivre un médicament anticancéreux, le paclitaxel, au sein d'une lignée de cellules cancéreuses vivantes Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7). Les images Raman ont été traitées par un algorithme de partitionnement des données par k-moyennes pour détecter le paclitaxel dans les cellules. La distribution du paclitaxel dans les cellules est vérifiée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson entre le spectre de référence du traitement et les spectres de l'image entière. Le temps progressif de diffusion du paclitaxel dans toute la cellule est observé. Cette observation demande une étude complémentaire sur l'action pharmaceutique du produit, basé sur la liaison rapide de la tubuline libre au paclitaxel cristallisé. L'apoptose dans les cellules a été suivies par partitionnement de données et par corrélation. Le partitionnement de données a été utilisé pour déterminer la position de mitochondries dans les cellules ; le cytochrome C de distribution à l'intérieur des cellules est basé sur l'analyse de corrélation. L'apoptose des cellules est défini par le cytochrome C dans le cytoplasme de diffusion. Le cytochrome C agit comme un déclencheur pour l'activation en cascade des caspases, et sa libération par les mitochondries est un signe d'apoptose. La Co-localisation de cytochrome C est effectuée après incubation de cellules avec une concentration différente de paclitaxel. L'autre produit étudié est le dioxyde de titane. Le titane est largement utilisé pour les matériaux orthopédiques et dentaires implantés dans le corps humain. Il est inévitable que le sang prenne contact avec la surface de l'implant et des nanoparticules. Les nanoparticules de dioxyde de titane ont été suivies en intracellulaire dans les cellules MCF-7 et TERT épithéliales humaines (lignée orale cellulaire de kératinocytes OKF6/TERT-2). La détection des nanoparticules et leur toxicité ont été étudiées en utilisant deux méthodes d'analyse. La microscopie confocale Raman a également été utilisée pour réaliser l'analyse structurale et chimique de la jonction émail-dentine-résine et de la carie dentaire, grâce à une analyse précise des constituants minéraux et organiques. La microscopie Raman associée à des méthodes d'analyse de données ouvre de nouvelles portes pour la recherche en biologie-santé et en particulier en odontologie.

  • Titre traduit

    The Study of living cells and human dentin by confocal Raman microscopy


  • Résumé

    "The Study of living cells and human dentin by confocal Raman microscopy"Confocal Raman microscopy is employed to trace drugs and nanoparticles intracellular and in hard tissues. Raman spectroscopy a non-invasive, label-free and high spatial resolution imaging technique in first part of the study is being used to trace the anticancer drug paclitaxel in living Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) cells. An analytical method was developed and applied to Raman data acquired. The Raman images were treated by K-mean cluster analysis to detect the drug in cells. Distribution of paclitaxel in cells is verified by calculating the Pearson correlation coefficient between the reference spectrum of the drug and the whole Raman image spectra. A time dependent gradual diffusion of paclitaxel all over the cell is observed suggesting a complementary picture of the pharmaceutical action of this drug based on rapid binding of free tubulin to crystallized paclitaxel. The apoptosis in the cells were followed by post-measurement analysis including K-mean clustering and Pearson correlation coefficient. K-mean clustering was used to determine mitochondria position in cells and cytochrome c distribution inside the cells was based on correlation analysis. Cell apoptosis is defined as cytochrome c diffusion in cytoplasm. Cytochrome c acts as a trigger for the activation of the caspase cascade, and its release from mitochondria is a sign of apoptosis. Co-localization of cytochrome c is done after cell incubation with different concentration of paclitaxel. The other product used was titanium dioxide. Titanium has been widely used for orthopedic and dental implant materials. When biomaterial is implanted into the human body, it is unavoidable that blood will contact the implant surface and nanoparticles. The question is: do these nanoparticles cause toxicity? Titanium dioxide nanoparticles were followed intracellular in MCF-7 cells and TERT epithelial human oral keratinocyte cell line (OKF6/TERT-2). Detection of nanoparticles and their toxicity were studied using two analytical methods. Confocal Raman microscopy were also used to obtain Structural analysis and chemical profile of Enamel – Dentine- Resin and Raman map of decay and sound dentin samples, through accurate analysis of the mineral and organic components. The Raman spectroscopy combined with this novel method developed in this study, will provide accurate finger prints of chemical composition and by post-measurement analysis of the data acquired more information would be obtained, which might open new gates in pharmaceutical and dentistry researches.

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