Développement d'une stratégie d'adressage sur or par chimie "click" électro-catalysée : application à la détection sans marquage de biomolécules

Addressing strategy on gold by electrocatalyzed « click » chemistry : label-free detection of biomolecules

• Auteur / Autrice : Micaël Ripert
• Direction : Carole Chaix
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance le 06/11/2013
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Chimie (Lyon ; 2004-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des Sciences Analytiques. Lsa
• Jury : Président / Présidente : Didier Léonard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nicole Jaffrezic-Renault, Stéphane Roux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Didier Gasparutto, François Morvan

Mots clés

Mots clés contrôlés

Électrocatalyse

Chimie click

Filtres à ADN

Ferrocène

Mots clés libres

Férrocène

Détection électrochimique

ADN

Puce à ADN

Chimie «click»

Électro-catalyse

Électrode d'or

Adressage

Ferrocene

Electrochemical detection

DNA

DNA microarray

Chemistry “click”

Electrocatalysis

Gold electrode

Adressing

Résumé

La réalisation de microsystèmes de multidétection et sans marquage pour la reconnaissance de biomolécules est d'un intérêt fondamental pour la réalisation de tests rapides dédiés au diagnostic biologique. Ces développements nécessitent une méthode d'adressage des sondes de capture sur une plateforme multiplexée associée à une méthode d'analyse sensible. Dans cette étude, la méthode de détection choisie pour les tests développés sur la puce est la voltampérométrie cyclique, et le férrocène a été utilisé pour la modification de sondes oligonucléotidiques de type tige-boucle. Une stratégie d'électroadressage a été développée sur surface d'or. Elle a été réalisée via chimie « click » entre un alcyne et un azoture. Cette réaction peut être électro-catalysée en maintenant le catalyseur cuivre sous sa forme active par l'application d'un potentiel à l'électrode. Une première entité chimique de petite taille, constituée de deux groupements dithiol phosphate et d'un groupement hexynyle a été synthétisé par synthèse supportée et greffée sur électrode d'or. Par la suite, différents éléments ont été immobilisés par chimie « click ». Un dérivé ferrocène porteur d'une fonction azoture a été utilisé pour la détermination des conditions optimales de cette chimie. Puis, cette méthode a été exploitée pour l'immobilisation de nanoparticules fluorescentes et de protéines par l'intermédiaire de la formation du complexe biotine/streptavidine. Enfin, cette méthode a permis l'électroadressage de sondes de capture oligonucléotidiques de type tige-boucle, modifiées par des ferrocènes. Des tests d'hybridation ADN ont été menés en milieu complexe avec une limite de détection déterminée à 100fM

This production of microsystem for label-free multi detection of biomolecules is fundamental for the realization of rapid tests dedicated to laboratory diagnosis. A viable method is requires to both address capture probes and to be associates with a sensitive analysis on multiplexed platform. In this study, the method chosen for detection on electrode is cyclic voltammetry, and ferrocene was used to modify stem-loop oligonucleotides. A strategy was developed for the electroadressing of probes on gold surface. It is performed through chemistry “click” between an alkyne and an azide. This reaction may be catalyzed by maintaining the correct potential to the electrode to form an active copper oxidation state on the surface. A first small chemical entity, containing two phosphate dithiol moieties and a hexynyl moiety was synthesized by supported chemistry and grafted on gold electrode. Thereafter, various elements were immobilized by chemistry “click”. Ferrocene derivative carrying an azide function was used to determine the optimal conditions for this chemistry. Then, this method has been exploited for the immobilization of proteins and fluorescent nanoparticles via the formation of biotin/streptavidin complex. Finally, this method allowed to electroaddress stem-loop oligonucleotids, designed as capture probes, modified by ferrocene. DNA hybridization tests were conducted in complex environments with a detection limit determined at 100 fM