Développement d’un nouveau système hybride de traduction in vitro et étude du rôle traductionnel de la protéine NS1 de l’Influenza A

Viral subversion of the host translational machinery occurred by Influenza A virus with a new in vitro approach

• Auteur / Autrice : Baptiste Panthu
• Direction : Théophile Ohlmann
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie
• Date : Soutenance le 05/09/2013
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre international de recherche en infectiologie (Lyon ; 2013-....)
• Jury : Président / Présidente : Patrice André
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Manuel Rosa-Calatrava, Daniel Marc
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Sargueil, Marcelo Lopez-Lastra

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ribosomes

Traduction génétique

Cellules -- Physiologie

Influenzavirus A

Mots clés libres

Traduction

Traduction in vitro

Ribosomes

NS1

Influenza

Virus

Translation

In vitro translation

Ribosomes

NS1

Influenza

Virus

Résumé

Le virus de l'Influenza A est l'agent étiologique des épidémies de grippe saisonnière. Ce virus a développé des stratégies complexes pour exprimer ses protéines dans les cellules hôtes dès 4 heures après infection. Au départ de cette étude, je me suis intéressé aux événements intervenant dans l'initiation de la traduction des ARN messagers viraux. L'infection par le virus de l'Influenza A perturbe profondément la physiologie cellulaire, et notamment les processus d'expression des gènes au niveau des étapes de transcription, maturation et export des ARN messagers. De ce fait, j'ai donc commencé par développer les outils permettant de m'affranchir de ces événements nucléaires pour pouvoir me focaliser sur les mécanismes viraux spécifiques de l'initiation de la traduction. Ainsi, j'ai conçu et élaboré un nouveau système de traduction in vitro qui dérive du lysat de réticulocytes de lapin dans lequel sont ajoutés des ribosomes isolés de cellules en culture. Ce lysat, dit hybride, présente l'avantage d'être très efficace pour la production de protéines tout en conservant les caractéristiques traductionnelles des cellules dont les ribosomes dérivent. Le second volet de mes travaux porte sur le rôle de la protéine virale NS1 au niveau de la traduction cellulaire et virale. En combinant des infections virales avec des expériences in vitro et ex-vivo, par transfection d'ARN, je montre que NS1 est capable de stimuler la synthèse protéique des ARNm cellulaires et viraux. Par de la mutagénèse dirigée sur cette protéine de 230 acides aminés, j'observe que la région amino-terminale de la protéine (aa 1-81) est responsable de cet effet activateur. Des mutations ponctuelles au sein de ce domaine révèlent l'importance de deux résidus aminés (R38 et K41) dans la stimulation. En résumé, ces travaux ont permis de mettre au point un nouveau système d'expression in vitro et de mieux comprendre comment est contrôlée la synthèse des protéines virales du virus Influenza A

Influenza A belongs to the orthomyxoviridae family and is the causal agent for the seasonal and epidemic Influenza infections. This virus has developed complex strategies to utilize the host cell protein apparatus for viral protein expression. In this study, I have focused on the events involved during the initiation of translation of viral mRNAs. Influenza A infection profoundly disrupts host cell gene expression mainly at the level of transcription, maturation and mRNA export. As such, it is quite difficult to investigate directly translational control of Influenza. Therefore, I have started my project by elaborating experimental tools that can be used for this purpose. This was done by designing and developing a new in vitro translation system derived from the rabbit reticulocyte lysate which is supplemented with exogeneous ribosomes that have been isolated from different cell types. This lysate, called hybrid system, offers the advantage to be very effective in the production of proteins while maintaining the translational characteristics of the cells from which the ribosomes originate. The second part of my work focusses on the role of the viral NS1 protein on cellular and viral translation. By using an experimental approach based on viral infections together with in vitro and ex vivo translational assays, I could show that NS1 is able to stimulate both viral and cellular protein synthesis. Then, the introduction of deletion mutants of this 230 amino acids protein revealed that its amino-terminal domain (aa 1-81) was responsible for this stimulatory effect (aa 1-81). Finally, the introduction of point mutations in this region showed the importance of two conserved positively charged residues (R38 and K41) for stimulation. In summary, these studies have yielded a new in vitro translation expression system and have shed light on how viral proteins synthesis is regulated by Influenza A virus