Développement des approches top-down par spectrométrie de masse pour l'analyse des pili de type IV

Development of Top-Down Mass Spectrometry Approaches for the Analysis of Type IV Pili

• Auteur / Autrice : Joseph Gault
• Direction : Julia Chamot-Rooke
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Palaiseau, Ecole polytechnique

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maturation post-traductionnelle des protéines

Spectrométrie de masse

Résumé

La caractérisation de protéines par spectrométrie de masse ''top-down'' (TDMS) possède plusieurs avantages sur l'approche ''bottom-up'' (BU), notamment pour la caractérisation des protéoformes; c'est-à-dire l'ensemble des protéines exprimées par la cellule, y compris celles portant les modifications post-traductionnelles (MPT). Dans cette thèse la TDMS a été développée pour l'analyse des pili de type IV (T4P) à la fois sur Orbitrap et sur FT-ICR. Les T4P sont des organelles extracellulaires composées principalement d'une protéine, la piline majeure, qui peut être fortement décorée par des MPT. Pour la piline majeure PilE, du pathogène humain Neisseria meningitidis (Nm), la TDMS a été optimisée pour obtenir la première caractérisation de toutes les protéoformes de PilE exprimées par une souche de référence et un rôle biologique a été proposé pour la MPT glycérophosphate. De plus la TDMS a été appliquée pour une étude à plus grande échelle des MPT des pili provenant des souches cliniques de Nm non-caractérisées. La comparaison des méthodologies TD et BU a révélé à la fois leur complémentarité et la faiblesse inhérente à l'approche BU pour la caractérisation complète de protéoformes. En combinaison avec d'autres techniques structurales, il a été montré que les pili exprimés par les souches de Nm de classe II sont fortement glycosylés, que la glycosylation est dirigée par la séquence de PilE, et que ces sucres modifient fortement la surface des fibres de pili. Ces observations ont amené à une hypothèse nouvelle sur le mécanisme d'évasion immunologique des T4P de classe II chez Nm. De plus la première caractérisation d'une T4P exprimée par une bactérie Gram positif a été réalisée.

Top-down mass spectrometry (TDMS) is an alternative protein characterisation strategy to the more widespread bottom-up (BU) approach. TDMS has the unique ability to fully characterise the variety of protein products expressed by the cell (proteoforms), including those bearing posttranslational modifications (PTMs). In this thesis TDMS has been developed on both FT-ICR and Orbitrap mass spectrometers for the analysis of type IV pili (T4P). This includes the first T4P to be visualised in a Gram positive bacterium (Streptococcus pneumoniae). T4P are filamentous, extracellular organelles primarily composed of a single protein subunit or major pilin that can be highly posttranslationally modified. For the major pilin, PilE, of the human pathogen Neisseria meningitidis (Nm), TDMS was extensively optimised and the first complete characterisation of all proteoforms of PilE from a single Nm strain performed. A biological role has been proposed for the enigmatic phosphoglycerol PTM. The approach was extended and applied in the first large scale study of PTMs on PilE from uncharacterised, pathogenic strains of Nm. Comparison of the TD and BU methodologies revealed both their complementarity and the inherent weakness of the BU approach for full proteoform characterisation. TDMS was combined with other structural techniques to reveal that pilins from the previously unstudied class II isolates of Nm are extensively glycosylated and that glycosylation is both driven by the primary structure of PilE and has a profound effect on pilus surface topology. These observations have been used to offer the first explanation of how T4P expressed by class II isolates of Nm avoid immune detection.