Invalidation du gène codant pour la Heat shock protein 27 chez la souris : un modèle pour comprendre le rôle de ce bio-marqueur de la tendreté de la viande bovine

Invalidation of the HSPB1 in mice : a model to understand the role of this biomarker of meat tenderness

• Auteur / Autrice : Malek Kammoun
• Direction : Brigitte Picard, Isabelle Cassar-Malek
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Nutrition et Sciences des Aliments
• Date : Soutenance le 09/10/2013
• Etablissement(s) : Clermont-Ferrand 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences de la vie, santé, agronomie, environnement (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Institut National de la Recherche Agronomique (France). Unité Mixte de Recherche sur les Herbivores (Clermont-Ferrand, Puy-de-Dôme)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité mixte de recherche sur les herbivores / UMRH
• Jury : Président / Présidente : André Lebert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Brigitte Picard, Ahmed Ouali, Lionel Tintignac
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Blanquet Véronique, Caroline Molette

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines de choc thermique

Bovins de boucherie

Mots clés libres

Hsp27

Muscle

Souris HspB1-/-

Ultrastructure

Interacteurs

Tendreté

Hsp27

Muscle

HspB1-null mice

Ultrastructure

Interactors

Tenderness

Résumé

La recherche des marqueurs biologiques de la tendreté a fait l’objet de nombreux travaux chez les animaux producteurs de viande et en particulier les bovins. A l’issue de ces études, une expression différentielle de la protéine Hsp27 entre des groupes de tendreté extrême a été mise en évidence. Cette protéine est présente à un « carrefour » biologique de l’interactome lié à la tendreté. Comprendre les mécanismes d’action de la protéine Hsp27 dans la tendreté de la viande bovine est l'un des défis de recherche dans le domaine de la production de viande. Dans cette optique, mon travail de thèse (2010-2013) avait pour objectif d’analyser le rôle de Hsp27 dans le développement du muscle et son implication dans le déterminisme des caractéristiques des tissus liés à la qualité de la viande. La première étape de ce travail a consisté à produire un modèle de souris présentant une inactivation du gène de la protéine Hsp27 (KO HspB1) et d’analyser leur phénotype comparativement à des témoins. Les souris KO HspB1 sont viables, fertiles et ne présentent aucune anomalie majeure, mais ont un format plus petit que celui de leurs témoins. L’analyse de leurs caractéristiques musculaires par une technique immunohistoligique mise au point spécifiquement (Publication 1) n’a pas révélé de différences. Au niveau ultrastructural, l'observation du muscle des souris par microscopie électronique à transmission a révélé des différences ultrastructurales entre les deux génotypes à T0 post-mortem avec des écarts entre les myofibrilles très espacées chez les souris KO HspB1 et un appareil contractile musculaire moins organisé. Ces différences sont encore plus marquées à T72 heures post-mortem. Ainsi le phénotype musculaire fin des souris KO HspB1 est plus altéré (Publication 2). Une analyse bio-informatique a été réalisée dans l'objectif de compléter la liste des interacteurs de la protéine Hsp27 et des gènes cibles de l’invalidation d’HspB1 susceptibles de participer à des différences de structure du muscle et de la tendreté. Les partenaires ou cibles prédits de Hsp27 sont des protéines impliquées dans différentes fonctions, comme des Heat shock proteines, des régulateurs de l'apoptose, des facteurs de traduction, des protéines du cytosquelette et des antioxydants. Les abondances de 15 protéines ont été quantifiées par Western-bloting dans deux muscles (m. Soleus, m. Tibialis). Elles sont modifiées chez les souris dépourvues de Hsp27 principalement dans le muscle le plus oxydatif. Cette étude démontre l'existence de liens fonctionnels entre Hsp27 et ses cibles prédites qui pourraient participer au phénotype fin des souris (Publication 3). Pour compléter cette étude, une analyse protéomique du muscle Tibialis anterior a été menée en utilisant la technique d’électrophorèse bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse. La comparaison des protéomes spécifiques de ces deux génotypes a permis de mettre en évidence des profils d’expression différents pour plusieurs protéines. Elle confirme l’effet muscle spécifique du KO et révèle un lien avec le métabolisme du calcium et des Hsps différentes de celles mises en évidence dans le muscle oxydatif (Publication 4). L'ensemble des données issues de cette étude réalisée dans une espèce modèle apporte des connaissances nouvelles susceptibles d’éclairer sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l’établissement de la tendreté de la viande bovine. Elle suggère que le statut en Hsp, les processus apoptotiques et la protection contre le stress oxydatif contribuent à l'évolution de l'ultrastructure post-mortem des muscles et à la tendreté de la viande. Ces nouvelles connaissances seront validées ultérieurement sur muscle bovin.

Thanks to genomics, we have previously identified markers of beef tenderness, and computed a bioinformatic analysis that enabled us to build an interactome in which we found Hsp27 at a crucial node. Understanding the role of Hsp27 in the development of muscle and in the determinism of beef tenderness is one of the research challenges in meat production. In this context, my pHDthesis (2010-2013) aimed to analyze the role of Hsp27 in muscle development and its involvement in the determination of the characteristics related to the quality of the meat tissue. In this study, we generated mice devoid of Hsp27 protein by homologous recombination of the HspB1 gene as an animal model. The HspB1-/ - mice were viable and fertile, showing no apparent abnormality but a smaller than their control format. The muscle structure of animals was examined by optical microscopy and transmission electron microscopy. The first approach, made by a developed immunohistochemical classification (Publication 1), did not reveal any differences in the characteristics of muscle fibers (contractile and metabolic type, shape, perimeter, cross-sectional area) but a trend for a higher proportion of small fibers. Different myosin heavy chains electrophoretic profiles were also observed in HspB1-/- mice. At the ultrastructural level, examination of the myofibrillar material showed destructured myofibrils and higher gaps between myofibrils in HspB1-/-, and a greater disintegration of myofibrils at 72h postmortem (Publication 2). We have used a network-based approach for understanding the contribution of Hsp27 to tenderness through the prediction of its interactors related to tenderness. We have revealed the direct interactors of Hsp27. The predicted partners of Hsp27 included proteins involved in different functions e.g. members of Hsp families, regulators of apoptosis, translation factors, cytoskeletal proteins and antioxidants. The abundances of 15 proteins were quantified by Western blotting in two muscles of HspB1-null mice and their controls. We observed changes in the amount of most of the Hsp27 predicted targets in mice devoid of Hsp27 mainly in the most oxidative muscle (Soleus. Our study demonstrates the functional links between Hsp27 and its predicted targets. It suggests that Hsp status, apoptotic processes and protection against oxidative stress are crucial for post-mortem muscle metabolism, subsequent proteolysis, and therefore for beef tenderness (Publication 3). To complete this study, we performed a proteomic analysis of m. Tibialis anterior (glycolytic muscle), using 2D gel electrophoresis, to detect changes in protein abundance subsequent to the invalidation of HspB1 gene. This study confirms the muscle specific effect of HspB1 invalidation and reveals a new list of Heat shock proteins different from those highlighted in oxidative muscle and relationships with calcium (Publication 4). All together, these results provided from a model species showed the very important role of Hsp27 for muscle ultrastructure and revealed its implication in different muscle biological pathways. This provided new elements for understanding the crucial role for Hsp27 in the modulation of the tenderizing process of muscle during meat ageing that will be further examined in beef.