L'étude du rôle et de l'expression de la protéine autophagique GABARAPL1 dans le système nerveux central et dans des modèles de cellules neuronales

A study of the role and expression of the autophagic protein GABARAPL1 in the central nervous system and in neuronal cell models

• Auteur / Autrice : Jaclyn Nicole Le Grand
• Direction : Régis Delage-Mourroux, Michaël Boyer-Guittaut
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 13/06/2013
• Etablissement(s) : Besançon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Estrogènes, expression génique et pathologies du système nerveux central (E2SNC) (Besançon) - Estrogènes, expression génique et pathologies du système nerveux central (E2SNC) (Besançon)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Gonzalez
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Régis Delage-Mourroux, Michaël Boyer-Guittaut, Bruno Gonzalez, Christian Gaiddon, Isabelle Lascombe, Frédéric Brischoux
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Bruno Gonzalez, Christian Gaiddon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mitochondries

Cellules souches neurales

Souris de laboratoire

Expérimentation animale

Autophagie

Système nerveux central

Génétique moléculaire

Mots clés libres

GECI/GABARAPL1

GABARAP

Système nerveux central

Macroautophagie

Mitophagie

GECI/GABARAPL1

GABARAP

Central nervous system

Macroautophagy

Mitophagy

Résumé

Le gène gec1/gabarapl1 (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identifié au sein de notre équipe, est un gène apparenté à la famille atg8 (autophagy related gene 8) et  la  sous-­‐famille  gabarap  (GABAA  receptor  associated  protein)  incluant  les  gènes  gabarap, gabarapl1, gabarapl2 et gabarapl3. Les protéines codées par ces gènes présentent de très fortes identités de séquences et des structures similaires. Le gène gabarapl1 est exprimé préférentiellement dans le SNC dans lequel il est le transcrit de la famille atg8 le plus fortement exprimé. Des études fonctionnelles ont démontré que la protéine GABARAPL1 intervient dans le trafic intracellulaire de récepteurs, et plus particulièrement  du  récepteur  GABAA  et  du  récepteur  aux  κ-­‐opioïdes,  via  son  interaction avec les microtubules. Cependant, le rôle de cette protéine ne se limite probablement  pas  au  seul  transport  de  ces  récepteurs.  Notre  équipe  a  d’ailleurs  récemment démontré que GABARAPL1 est impliquée dans le processus d’autophagie, un mécanisme de dégradation cellulaire. Dans  le  cadre  de  ma  thèse,  j’ai  eu  trois  objectifs :  (1)  l’étude  de  la  spécificité  d’anticorps anti-­‐GABARAPL1 commerciaux disponibles, (2) la cartographie détaillée de l’expression de GABARAPL1 dans le cerveau murin et (3) l’étude de la surexpression de GABARAPL1 dans un modèle neuronal in vitro en conditions de stress mitochondriaux. Etant donné la forte homologie entre GABARAPL1 et GABARAP, aucun anticorps spécifique  commercial  n’était  disponible  lorsque  nous  avons  débuté  mon  projet  de  recherche. Nous avons donc, dans un premier temps, étudié la spécificité des différents anticorps commerciaux anti-­‐GABARAPL1 disponibles et identifié un anticorps capable de détecter de façon spécifique cette protéine in vitro et in vivo. Grâce  à  cet  anticorps  spécifique,  nous  avons  ensuite  entrepris  l’étude  de  l’expression in vivo de la protéine GABARAPL1 dans le SNC de souris chez l’adulte et au cours du développement embryonnaire. Nous avons ainsi démontré que GABARAPL1 est exprimée dans les neurones immatures et les fibres neuronales à partir du 11e jour de  développement  et  son  expression  augmente  progressivement  jusqu’à  un  taux  maximal observé chez l’adulte. Chez l’adulte, GABARAPL1 est exprimée uniquement dans  les  neurones  et  plus  particulièrement  dans  ceux  impliqués  dans  les  fonctions  motrices et neuroendocrines. De plus, nous avons noté que le marquage ponctiforme de  GABARAPL1  co-­‐localise  partiellement  avec  p62  dans  des  cultures  neuronales  primaires, confirmant son association aux vésicules autophagiques in vivo. Pour caractériser la fonction cellulaire de GABARAPL1, nous avons surexprimé cette protéine dans des cellules neuronales SK-­‐N-­‐BE(2). L’étude de ce nouveau modèle neuronal a montré que la surexpression de DsRed-­‐GABARAPL1 semble potentialiser la réponse  autophagique  des  cellules,  ce  qui  permet  une  induction  plus  précoce  suite  à  des traitements induisant l’autophagie. De plus, la surexpression de GABARAPL1 inhibe la mort des cellules soumises à des stress ciblant les mitochondries (CCCP), ce qui  suggère  que  GABARAPL1  pourrait  protéger  les  neurones  contre  certains  stress  aggravant la progression des maladies neurodégénératives. L’ensemble  de  ces  travaux  a  permis  d’identifier  un  outil  spécifique  à  l’immunodétection de GABARAPL1, de cartographier son expression dans le SNC murin au cours du développement et chez l’adulte et finalement, de démontrer un rôle protecteur  de  GABARAPL1  contre  la  mort  neuronale  induite  par  un  stress  mitochondrial.

The gec1/gabarapl1 gene (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identified within our team, is a gene related to the atg8 (autophagy related gene 8) family and the gabarap (GABAA receptor-­‐associated protein) subfamily of genes including gabarap, gabarapl1, gabarapl2 and gabarapl3. The protein products of these genes present a very strong sequence identity and are structurally similar. The gabarapl1 gene is expressed preferentially in the central nervous system, in which it is the most highly expressed transcript of the atg8 family. Functional studies have shown that the GABARAPL1 protein is involved in intracellular trafficking of receptors, in particular the GABAA receptor and the κ-­‐opioid receptor, via its interaction with cytoskeletal elements. The role of this protein, however, is clearly not limited to the transport. Our team has also recently shown that GABARAPL1 is involved in the autophagic process, a cellular degradation mechanism. My thesis objectives were three-­‐tiered: (1) the study of the specificity of anti-­‐GABARAPL1 antibodies, (2) the detailed mapping of GABARAPL1 expression in the mouse brain and (3) the study of GABARAPL1 overexpression under conditions of mitochondrial stress in an in vitro neuronal model. Given the high homology between GABARAPL1 and GABARAP, no commercially available specific antibody was available when we started my research project. As such, we conducted a study on the specificity of different commercially available anti-­‐GABARAPL1 antibodies and identified an antibody that specifically recognized this protein in vitro and in vivo experiments. With this specific antibody, we then undertook a study of the in vivo expression of the GABARAPL1 protein in the adult mouse central nervous system and throughout embryonic development. In this study, we demonstrate that GABARAPL1 is expressed in immature neurons and neural fibers in the embryo from the 11th day of embryonic development and its expression gradually increases to a maximum in adults. In adults, GABARAPL1 is expressed in neurons, in particular, in those involved in motor control and neuroendocrine functions. The punctate labeling of GABARAPL1 partially co-­‐localizes with p62 in primary neuronal cultures, confirming its association with autophagic vesicles in vivo. To characterize the cellular function of GABARAPL1, we overexpressed this protein in neuronal SK-­‐N-­‐BE (2) cells. The study of our neuronal cell model revealed that overexpression of DsRed-­‐GABARAPL1 appears to prime cells for autophagy, resulting in an earlier induction of autophagy after treatments that induce this processes. In addition, overexpression of this protein delays cell death in a CCCP-­‐induced mitochondrial stress model, suggesting that GABARAPL1 could protect neurons against certain stresses known to contribute to the development of neurodegenerative diseases. Together, this work has identified a specific tool for the immunodetection of GABARAPL1, produced a detailed map of GABARAPL1 expression in the developing and adult murine central nervous system and finally, demonstrated a protective role for GABARAPL1 against neuronal death induced by mitochondrial stress.