Étude du recrutement de la nucléase EndA au sein du complexe de transport de l'ADN transformant chez Streptococcus pneumoniae

Study of EndA recruitment into the DNA uptake complex during natural transformation in Streptococcus pneumoniae

• Auteur / Autrice : Matthieu Bergé
• Direction : Jean-Pierre Claverys, Nathalie Campo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et génétique
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nucléases

Transport physiologique

ADN

Pneumocoque

Mots clés libres

Streptococcus pneumoniae

Transformation

ADN Transformasome

Complexe protéique membranaire

Localisation

Immuno-précipitation

EndA

Résumé

La transformation est un mécanisme largement répandu dans le monde bactérien permettant des échanges génétiques via la capture d'ADN exogène. Elle requiert généralement le développement d'un état physiologique transitoire, la compétence, au cours de laquelle sont néo-synthétisées les protéines essentielles à la capture de l'ADN du milieu extérieur, à sa traversée de la paroi cellulaire, à son internalisation dans le cytoplasme sous forme simple brin et à son intégration dans le génome par recombinaison homologue. Collectivement, ces protéines définissent l'appareil de transformation génétique, l'ADN Transformasome, dont la caractérisation est la plus avancée pour les bactéries modèles Streptococcus pneumoniae et Bacillus subtilis. Mon projet de thèse visait à caractériser la dynamique de mise en place de la partie du transformasome en charge du transport de l'ADN exogène au travers de la membrane cytoplasmique chez S. Pneumoniae. Pour cela, j'ai principalement utilisé (et adapté au pneumocoque) des techniques de biologie cellulaire permettant de suivre par épifluorescence l'assemblage de ce pore d'entrée de l'ADN transformant dans des cellules vivantes. Ainsi, j'ai pu mettre en évidence un retard du processus de septation cellulaire lors du premier événement de division qui suit l'induction de la compétence. Pour localiser le pore d'entrée du transformasome, j'ai étudié la localisation de l'endonucléase membranaire EndA, en charge de la dégradation à l'extérieur de la cellule du brin complémentaire de l'ADN transformant internalisé. Contrairement à toutes les autres protéines du Transformasome, EndA est exprimée de manière constitutive. Mes résultats montrent que, d'une part, EndA localise de manière homogène dans la membrane des cellules non compétentes et, d'autre part, forme des foci dans les cellules compétentes. La formation des foci d'EndA est dépendante de la protéine membranaire ComEA du Transformasome, dont le rôle est de recevoir l'ADN double-brin exogène au niveau du pore pore d'entrée. Lorsque la capacité de transformation est maximale, EndA et ComEA sont préférentiellement localisées au niveau de la zone équatoriale des cellules. Par ailleurs, j'ai pu montrer que l'ADN transformant marqué par des fluorophores se concentre aussi principalement à la zone équatoriale des cellules compétentes. Dans l'ensemble, ce travail suggère que l'assemblage du pore d'entrée de l'ADN transformant chez S. Pneumoniae se ferait à la zone équatoriale des cellules compétentes. Chez B. Subtilis il a été montré que la fixation de l'ADN a lieu aux pôles des cellules compétentes. Ainsi, bien que les composantes des transformasomes de B. Subtilis et de S. Pneumoniae soient très conservées, il semble qu'une (ou des) caractéristique(s) propre(s) à ces deux espèces bactériennes déterminent le site d'assemblage du pore d'entrée de l'ADN transformasome dans la membrane.

Natural genetic transformation is widely distributed in bacteria, allowing genetics exchange. Transformation requires a specialized membrane-associated complex which forms a DNA entry pore allowing internalization of exogenous single-stranded DNA (ssDNA). It also requires dedicated cytosolic proteins to integrate internalised ssDNA into the chromosome by homologous recombination. This complex, named DNA Transformasome, has been intensively studied in the human pathogen S. Pneumoniae and the soil bacteria B. Subtilis. The aim of my project was to characterize the membrane-associated complex in S. Pneumoniae. I adapted two complementary cellular biology methods. To identify physical links between Transformasome components, I developed a method to purify membrane complexes in S. Pneumoniae. Moreover, I performed fluorescence microscopy, which allows us to track and record individual bacterial cells of S. Pneumoniae upon competence induction. Using GFP (Green Fluorescent Protein) fused to a key division protein FtsZ, I demonstrated a delayed septation process in competent cells. To visualize the integration of components of the DNA entry pore, I focused on EndA. EndA is a sequence non-specific endonuclease bound to the membrane which is responsible for processing double-stranded DNA into single-stranded fragments that in turn enter the microbial cell. This nuclease has been identified only in the streptococcal system. Remarkably, EndA is the only known component of the DNA entry pore that is constitutively expressed in non-competent cells and is not induced in competence. I showed that EndA concentrates into localized foci upon competence induction. This specific localization depends on the presence of the DNA-receptor, ComEA. Moreover, EndA and ComEA appear preferentially located at midcell in cultures exhibiting optimal transformation efficiency. Similarly, binding of extracellular DNA was localized to the cell centre. Together, our results are consistent with a model in which the active entry pore for DNA transformation is located at the septum in pneumococcal cells. In contrast, it appears that the entire process of DNA transformation localizes at the cell poles in B. Subtilis. Although components of Transformasome are conserved between species, it appears that bacteria have adapted the transformation process according to their own physiology.