Développement de méthodes quantitatives sans marquage pour l'étude protéomique des cellules endothéliales

Development of label free quantitative methods for the proteomics study of endothelial cells

• Auteur / Autrice : Violette Gautier
• Direction : Bernard Monsarrat, Anne Gonzalez de Peredo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules endothéliales

Protéomique

Mots clés libres

Protéomique

Spectrométrie de masse

Cellules endothéliales

Complexes protéiques

Protéomes entiers

Glycoprotéomes

Protéines THAP

Tfiih

Interleukine-33

Résumé

La compréhension du fonctionnement des systèmes biologiques, dont les protéines sont les principaux effecteurs, est un défi majeur en biologie. La protéomique est aujourd'hui l'outil incontournable pour l'étude des protéines. Au cours de ma thèse, j'ai donc utilisé différentes approches protéomiques pour répondre à plusieurs questions biologiques autour des cellules endothéliales, concernant l'étude de mécanismes fonctionnels de protéines d'intérêt ainsi que des processus inflammatoires au sein de ces cellules. Ces différentes études ont nécessité la mise en place et l'optimisation de méthodes de quantification sans marquage ('' label free '') essentielles à la fois pour la caractérisation de complexes protéiques et pour l'analyse de protéomes entiers. Cette thèse décrit ainsi dans un premier temps l'utilisation de telles approches pour l'analyse de complexes immunopurifiés dans laquelle un enjeu important consiste souvent à discriminer de façon non ambiguë les composants bona fide du complexe par rapport aux contaminants non-spécifiques. J'ai ainsi notamment pu identifier certains partenaires spécifiques d'une nouvelle famille de facteurs de transcription humains, les protéines THAP, qui jouent un rôle clé dans la prolifération des cellules endothéliales. Dans un second temps, les processus activés par les cellules endothéliales en condition inflammatoire ont été étudiés au niveau de sous-protéomes ou à l'échelle de protéomes entiers, faisant appel à des méthodes de protéomique globale associées à des stratégies de quantification sans marquage. Le glycoprotéome des cellules endothéliales a ainsi d'une part été étudié lors la réponse inflammatoire, grâce à la mise en place d'une méthode d'enrichissement du protéome de surface des cellules. D'autre part, une analyse du protéome entier de ces cellules et de ses modulations lors de la stimulation par des cytokines pro-inflammatoires a également été réalisée. De façon à obtenir une couverture du protéome la plus profonde possible, cette étude a nécessité la mise en place d'une stratégie quantitative impliquant un fractionnement de l'échantillon sur gel 1D. Enfin, une troisième partie s'intéresse plus spécifiquement aux rôles et aux mécanismes d'action de l'interleukine-33 au sein des cellules endothéliales et a requis l'utilisation des méthodes quantitatives précédemment optimisées.

Understanding biological systems, in which proteins are the main effectors, is a major challenge in biology. Proteomics is now an indispensable tool for the study of proteins. During my PhD, I used different proteomic approaches to address several biological questions about endothelial cells for the study of functional mechanisms of proteins of interest as well as inflammatory processes in these cells. These studies involved the development and the optimization of label-free quantitative methods, essential both for the characterization of protein complexes and for the analysis total proteome. This thesis describes first the use of such approaches for the analysis of immunopurified complexes, for which an important issue is often to discriminate unambiguously bona fide components of the complex from non-specific proteins. I could identify specific partners of a new family of human transcription factors, the THAP proteins, which play a key role in endothelial cells proliferation. Then, the processes activated in endothelial cells under inflammatory condition were studied at sub-proteome or entire proteome level, using global proteomics strategies associated with label-free quantification. On the one hand, the glycoproteome has been studied under inflammatory conditions, through the establishment of a method for cell surface proteome enrichment. On the other hand, a whole proteome analysis of these cells was performed after stimulation with pro-inflammatory cytokines. To obtain deep proteome coverage, this study required the implementation of a quantitative strategy involving sample fractionation by 1D gel. Finally, the third section focuses specifically on the roles and mechanisms of action of interleukin-33 in endothelial cells, and required the use of quantitative methods previously optimized.