Caractérisation structurale et fonctionnelle de PorA et PorH : les deux majeures porines de corynebacterium glutamicum

Structural and functional characterization of PorA and PorH : the two major porins from Corynebacterium glutamicum

• Auteur / Autrice : Parthasarathi Rath
• Direction : Alain Milon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Corynebacterium glutamicum

Protéines membranaires

Mots clés libres

Ion channels

Porins

Protein expression and purification

Cell-free expression

Mycolic acids

Solution and solid state NMR

Mass spectrometry

Black lipid membrane measurements

Electron microscopy

Résumé

PorA (5 kDa) et PorH (7kDa) sont les deux protéines membranaires majeures de la membrane externe de Corynebacterium glutamicum qui appartient au groupe supragénérique des bactéries Gram-positives contenant plusieurs agents pathogènes i. E. Mycobacterium tuberculosis, M. Leprae et C. Diphtheriae. Les deux protéines forment des canaux ioniques hétéromériques et présentent la particularité d'avoir une modification post-traductionnelle : estérification par l'acide mycolique. Les deux protéines ont été produites dans deux systèmes d'expression : chez C. Glutamicum et dans un système acellulaire utilisant des extraits de E. Coli. La présence ou l'absence de modification post-traductionnelle, sur les protéines produites in vivo et in vitro a été caractérisée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les spectres de dichroïsme cellulaire et de RMN de PorA et PorH uniformément marquées et solubilisées en micelles de LDAO sont caractéristiques de protéines mono-disperses, partiellement structurées, et de qualité compatible avec une détermination de structure par RMN. Le test fonctionnel des protéines, par mesure de conductivité ionique après reconstitution dans une membrane lipidique (technique dite de BLM pour '' black lipid membrane '') a montré que a) la modification post-traductionnelle de PorA par un acide mycolique est essentielle (contrairement à celle de PorH) b) la présence simultanée de PorA et de PorH est requise pour la formation d'un canal ionique voltage dépendant typique d'une porine. Afin de mieux comprendre l'importance de l'acide mycolique pour l'activité canal ionique, le complexe protéique PorA-PorH a été reconstitué dans son environnement naturel. Les principaux lipides de la membrane externe du C. Glutamicum [Tréhalose dimycolate (TDM), tréhalose monomycolate (TMM) et cardiolipide (CL)] ont été extraits et purifiés par chromatographie d'adsorption et échange d'ions, sous forme protonée et sous forme perdeutériée. Après formation de protéoliposomes les propriétés membranaires de TDM seul ou en mélange avec CL ont été étudiées RMN du deutérium, diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique. L'insertion de PorA et PorH dans des vésicules de TDM a permis de mettre en évidence la reconstitution de l'hétéro-oligomère (contrairement aux micelles de LDAO). Ceci ouvre la voie à la détermination de structure 3D du complexe PorA-PorH fonctionnel par RMN solide et/ou liquide.

PorA (5 kDa) and PorH (7 kDa) are two major membrane proteins from the outer membrane of Corynebacterium glutamicum which belongs to the suprageneric group of Gram-positive bacteria containing number of human pathogens such as Mycobacterium tuberculosis, M. Leprae and C. Diphtheriae. Both PorA and PorH have been shown to form heteromeric ion channels and to be post-translationally modified by mycolic acids (a-alkyl, beta-hydroxy fatty acids). Both proteins were produced in their natural host with mycolic acid modification, as well as in E. Coli based continuous exchange cell-free expression system and thus devoid of mycolic acid modification. The presence or absence of mycolic acid modification on in vivo and in vitro expressed proteins was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry. CD and NMR spectra of 15N/13C uniformly labeled PorA and PorH solubilized in LDAO micelles indicated mono-dispersed and partially folded proteins, compatible with structure determination by NMR. However, functional assays (via black lipid membrane ion-channel conductance measurements) confirmed that a complex associating both proteins is required for function and that the mycolic acid modification on PorA (but not PorH), is an absolute requirement for the formation of a voltage dependent ion-channel. To understand further the importance of covalent or non-covalent interaction of their natural lipid environment on the complex formation, the major C. Glutamicum outer membrane lipids [Trehalose dimycolate (TDM), Trehalose monomycolate (TMM) and Cardiolipin (CL)] were purified using adsorption and ion exchange chromatography, both in protonated and perdeuterated form. Prior to proteoliposome reconstitution, the membrane forming properties of TDM alone or in mixture with CL were studied by 2H-NMR, Dynamic Light Scattering and Electron Microscopy. Furthermore, after in vitro reconstitution of PorA and PorH in TDM vesicles (and not in LDAO micelles or DMPC vesicles), evidence for the formation of the hetero oligomeric complex was observed. The 3D structure determination, by liquid and/or solid state NMR, of a functional PorA-PorH complex in its natural lipid environment is now feasible.