Nouveau biomarqueur en temps réel de cassures double-brin de l'ADN et génotoxicité de la cytolethal distensing toxin

Real-time biomarker of DNA double-strand breaks and cytolethal distending toxin genotoxicity

• Auteur / Autrice : Yoann Fedor
• Direction : Gladys Mirey, Bernard Salles
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Toxicologie génétique

Protéines recombinées

ADN -- Réparation

Mots clés libres

Cassure double-brin

Signalisation des dommages

Nanobody VHH

Cytolethal distending toxin

Intrabody

Génotoxicité

Toxine bactérienne

Résumé

L'ADN est constamment la cible de dommages, provenant aussi bien de sources endogènes (propriétés intrinsèques de la macromolécule, métabolisme cellulaire. . . ) qu'exogènes (radiations, contaminants alimentaires. . . ). Parmi ces dommages, les cassures double-brin de l'ADN (CDB) représentent une des lésions les plus cytotoxiques. En réponse à ce danger, la cellule dispose de voies de détection et signalisation impliquant le recrutement de protéines. Au cours de cette réponse des modifications post-traductionnelles de protéines de signalisation et de réparation sont produites au niveau du site de cassure comme, par exemple, la phosphorylation de H2AX, un variant de l'histone H2A. Cette voie de signalisation permet d'une part d'activer les points de contrôle du cycle cellulaire pour stopper la prolifération et, d'autre part, de stimuler les systèmes de réparation de CDB afin de restaurer l'intégrité de l'ADN. Une réparation infidèle des CDB peut aboutir à des additions/délétions de bases, voir des réarrangements chromosomiques, à l'origine de cancers. Ainsi, élucider les causes et les mécanismes responsables de la formation des CDB en réponse à des stress génotoxiques et suivre leur prise en charge par la cellule sont des éléments importants pour la compréhension de la génotoxicité. Des techniques permettant d'analyser la formation des CDB (immunofluorescence, électrophorèse en champs pulsé, COMET neutre. . . ) existent, mais elles ne permettent d'analyser l'état de l'ADN qu'à un instant fixe. La première partie de mon travail de thèse a été de créer un outil innovant, permettant de détecter et suivre la formation de CDB en temps réel, sur cellules vivantes. Cet outil repose sur la technologie des nanobodies, anticorps monochaines produits uniquement chez les camélidés et certains requins. Nous avons fait exprimer un nanobody intracellulaire dirigé contre H2AX phosphorylé (appelé gammaH2AX), qui semble se relocaliser aux CDB créées par microirradiation. La création de cet outil a nécessité l'immunisation d'un lama avec le peptide phosphorylé et l'isolement/le clonage des séquences codantes des nanobodies afin de produire une banque. Les nanobodies spécifiques de gammaH2AX ont été sélectionnés par phage display et leurs séquences ont été exprimées en cellules humaines, fusionnées à un fluorophore afin d'observer leur relocalisation aux CDB en temps réel. La seconde partie de ma thèse a permis de mieux comprendre le mécanisme d'action d'une génotoxine bactérienne, responsable de cancers en modèle murin : la Cytolethal Distending Toxin (CDT). Cette toxine, sécrétée par des bactéries commensales et pathogènes, se localise au noyau des cellules cibles et provoque des CDB. Si le fonctionnement de cette toxine était préalablement décrit comme celui d'une nucléase produisant des CDB directes, mon travail a montré que pour des concentrations équivalentes à la Dose Létale 50, CDT produit d'abord des cassures simple-brin qui dérivent en CDB au cours de la réplication de l'ADN. De plus, la réparation de ces CDB par recombinaison homologue est cruciale pour la survie des cellules exposées à CDT. En conclusion, mon travail de thèse a permis d'une part de développer un outil innovant permettant d'analyser la dynamique en temps réel des CDB en cellules humaine et, d'autre part, d'éclaircir le mécanisme menant à la génotoxicité de CDT, toxine représentant un risque potentiellement cancérigène chez les mammifères. Les apports de ces travaux sont discutés ici.

Human DNA is constantly damaged by endogenous (cellular metabolism) or exogenous (radiations, food contaminants) sources. Among these lesions, DNA double-strand breaks (DSB) are the most cytotoxic. To survive to these lesions, a cellular pathway is in charge for the detection and the signaling of DSB. This pathway involves recruitment and post-translationnal modifications of several proteins around the DSB site (like the phosphorylation of a H2A histone variant called H2AX). This signalization pathway elicits cellular checkpoints in order to stop proliferation, and stimulates DSB repair systems in order to restore DNA initial integrity. An error-prone repair of DSB can lead to base additions/deletions, or chromosomal aberrations that can induce cancer. In order to understand genotoxicity, it is important to elucidate causes and mechanisms responsible for DSB formation and to follow their management by the cell. Techniques allowing DSB formation analysis (immunofluorescence, pulse-field gel electrophoresis, neutral COMET assay. . . ) exist, but can only show DNA state for a given point. During the first part of my thesis work, I created a new tool to detect and follow DSB formation in real time, in human cells. This tool rely on nanobody technology, which are miniatures antibodies produced by camelidae species and some sharks. An intracellular nanobody directed against phosphorylated H2AX (gammaH2AX) has been expressed, and seems to relocate to microirradiation-induced DSB. In order to build this tool, anti-gammaH2AX peptides were designed to immunize a llama, and nanobodies coding sequences were isolated/cloned and gathered as a library. Nanobodies specific for gammaH2AX were selected by phage display. Fused to a fluorophore these nanobodies were expressed in human cells in order to analyze their relocalization to DSB in real time. The second part of my phD shed a new light on the mechanism of action of a bacterial génotoxine causing cancers in mouse models: the Cytolethal Distending Toxin (CDT). This toxin is secreted by commensal and pathogenous bacteria, translocate into the nucleus of targeted cells and induces DSB. CDT mechanism of action was previously described as those of a nuclease inducing DSB. But my work demonstrated for lower doses (equivalent to lethal dose 50), that CDT induced first single-strand breaks leading to double-strand breaks through DNA replication. Moreover, homologous recombination repair of these DSB is crucial in order for cells exposed to CDT to survive. In conclusion, thanks to my thesis work, I developed a new tool to analyze real time dynamic of DSB in human cells in one hand. And in another hand, my work shed a new light on the mechanism of action of CDT genotoxicity, a toxin displaying cancer hazard in mammalians. Contributions brought by this work are discussed here.