Etude des formes non natives du cytochrome c humain

Study of human cytochrome c non-natives forms

• Auteur / Autrice : Matthieu Simon
• Direction : Arnaud Bondon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie et sciences de la santé
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Rennes 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Vie-Agro-Santé (Rennes)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université européenne de Bretagne (2007-2016)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cardiolipides

Cytochromes c

Hème

Cardiolipine

Résonance magnétique nucléaire

Apoptose

Membranes (biologie)

Cytochrome c

Résumé

Le cytochrome c est impliqué dans le déclenchement de l’apoptose par l’acquisition d’une activité peroxydase. L’acquisition de cette activité est liée à des modifications structurales de la protéine en interaction avec les cardiolipides présents dans la membrane interne mitochondriale. Cependant, la nature exacte des formes non natives du cytochrome c en interaction avec la membrane fait encore débat. Au cours de cette étude, en utilisant des cytochromes c humain (le sauvage, deux simples mutants histidines et le double mutant correspondant) ainsi que des micelles et des vésicules lipidiques comme modèles membranaires, nous avons réussi, en utilisant la spectroscopie UV-visible, le dichroïsme circulaire et la RMN, à caractériser la nature du sixième ligand axial qui remplace la méthionine native. En effectuant des titrations en pH, nous avons pu identifier les acides aminés en interaction avec le fer de l’hème sur une large gamme de pH. Le remplacement de la méthionine par une lysine a été uniquement observé à des valeurs de pH supérieures à 8,5, alors que l’interaction des histidines avec le fer de l’hème est dépendante de la concentration micellaire et du pH. La gamme de variation de pH correspondant à la protonation des histidines est faible et compatible avec les variations de pH observées au cours de l’apoptose. Ces résultats nous ont permis d’exclure les lysines comme sixième ligand de la protéine à des pH proches de la neutralité, et de renforcer la prédominance des histidines et plus particulièrement de l’histidine 33 pour jouer ce rôle. Enfin, en se basant sur les résultats obtenus in vitro et des simulations par dynamiques moléculaires, nous proposons un modèle 3D du cytochrome c en interaction micellaire.

In addition to its electron transfer activity, cytochrome c is now known to trigger apoptosis via peroxidase activity. This new function is related to a structural modification of the cytochrome upon association with anionic lipids, particularly cardiolipin present in the mitochondrial membrane. However, the exact nature of the non-native state induced by this interaction remains an active subject of debate. In this work, using human cytochromes c (native, two single-histidine mutants and the corresponding double mutant) and micelles or small unilamellar vesicles as a hydrophobic medium, we succeeded, through UV–visible spectroscopy, circular dichroism spectroscopy and NMR spectroscopy, in fully characterizing the nature of the sixth ligand replacing the native methionine. Furthermore, careful pH titrations permitted the identification of the amino acids involved in the iron binding over a range of pH values. Replacement of the methionine by lysine was only observed at pH above 8. 5, whereas histidine binding is dependent on both pH and micelle concentration. The pH variation range for histidine protonation is relatively narrow and is consistent with the mitochondrial intermembrane pH changes occurring during apoptosis. These results allow us to rule out lysine as the sixth ligand at pH values close to neutrality and reinforce the role of histidines (preferentially His33 vs His26) as the main candidate to replace methionine in the non-native cytochrome c. Finally, on the basis of these results and molecular dynamics simulations, we propose a 3D model for non-native cytochrome c in a micellar environment.