Etude de l’efficacité d’oligonucléotides leurres de STAT3 dans des cellules tumorales : Analyse de la spécificité et élaboration de séquences discriminantes

Analysis of the efficiency of STAT3-inhibitting decoy oligodesoxynucleotides in tumor cells. Study of their specificity and design of discriminating sequences

• Auteur / Autrice : Inès Souissi
• Direction : Remi Fagard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 13

Mots clés

Mots clés contrôlés

Caryophérines

Prolifération cellulaire

Mort cellulaire

Oligonucléotides

Résumé

STAT3 est un facteur de transcription de la famille des STATs «Signal Transducer and Activator of Transcription ». Son activation par des cytokines comme l'IL-6 entraine sa localisation nucléaire, l'activation de gènes cibles et la prolifération cellulaire. Des oligonucléotides leurres en épingle à cheveux (hpdODNs) et porteurs de la séquence consensus de STAT3 induisent la mort de cellules de lignée de cancer du colon dans lesquelles STAT3 est activé. Cependant, le hpdODN est également reconnu par STAT1 activé et protège les cellules contre l'apoptose induite par l'IFNy. Nous montrons que le hpdODN interagit avec STAT3 dans le cytoplasme et bloque sa pénétration nucléaire en empêchant son interaction avec l'importine, essentielle au transport nucléaire de STAT3 activé. Dans le but d'obtenir un hpdODN spécifique de STAT3, l'analyse comparative du DNA Binding Domain (DBD) de STAT3 et STATI complexé à l'ADN cible a été réalisée avec un programme d'analyse 3D. Les substitutions de nucléotides ont été testées dans les cellules de lignée de cancer du colon traitées ou non à l'IFNy. Un hpdODN spécifique a été conçu : il inhibe STAT3 et a une action minimale sur STAT1. Des hpdODNs spécifiques de STATS ont également été analysés et testés. Ils induisent la mort de cellules tumorales sanguines dans lesquelles STATS est activé. Par ailleurs, la pénétration des hpdODNs a pu être améliorée par utilisation de nanoparticules magnétiques. Ces résultats avec les hpdODNs suggèrent que le DBD de STAT3 est une bonne cible ; ce hpdODN pourrait être utilisé comme base pour la conception de molécules interagissant avec le DBD mais capables de traverser la membrane par elles mêmes.

STAT3 is a transcription factor of the STAT « Signal Transducer and Activator of Transcription » family. Triggering of cytokine receptors, such as IL-6, activates kinases of the JAK family and results in phosphorylation and dimerization of STAT3. The dimerized STAT3 penetrates the nucleus, binds its targets and activates their transcription. STAT3 is frequently activated in tumor cells; its inhibition generally leads to the death of these cells. STAT1 is another STAT family member; its activation is most of the time linked with cell death or resistance to pathogens. Intriguingly, STAT1 and STAT3, through their DNA Binding Domain (DBD) interact with very similar DNA sequences. In order to achieve specific inhibition of STAT3, hairpin decoy oligodeoxynucleotide sequences (hpdODN) were used. Transfection of the hpdODNs resulted in cell death in the colon carcinoma cell line SW480, demonstrating the efficiency of targeting STAT3's DBD. However, STAT1-dependent Interferon y-induced cell death was blocked by the hpdODN in these cells, suggesting a lack of specificity. Analysis of the mechanism of action of the hpdODN showed that its interaction with activated dimeric STAT3 takes place in the cytoplasm. We further demonstrated that binding of the hpdODN to dimeric STAT3 prevented the binding of importin thereby impairing importin-mediated transport through the nuclear pore. Finally, STAT3 hpdODN complexed with magnetic nanoparticles was tested and found to improve penetration of the hpdODN. An hpdODN inhibiting STATS was tested and found to induce death of hematologic tumor cells with activated STAT5. To further investigate and improve the hpdODN's specificity, comparative 3D analysis of the STAT3 and STAT1 DBDs was conducted. Modifications in the hpdODN sequence were subsequently tested in the SW480 cell line. The new hpdODN induced cell death without preventing interferon y-induced cell death, indicating that the DBD can be used as a basis for specific inhibitory reagents.