CEMOVIS, développements méthodologiques et étude ultrastructurale de la cellule HT29 : De la cellule aux nucléosomes

CEMOVIS methodological developments and structural study of HT 29 cell : from cell to nucleosoms

• Auteur / Autrice : Nicolas Lemercier
• Direction : Françoise Livolant, Amélie Leforestier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 23/03/2012
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Innovation Thérapeutique : du Fondamental à l'Appliqué (Châtenay-Malabry, Haut-de-Seine ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physique des solides (Orsay, Essonne)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Françoise Livolant, Jean-Jacques Lacapère
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Denis Chrétien, Benoît Zuber

Mots clés

Mots clés contrôlés

Conduction électrique

Spectroscopie de perte d'énergie des électrons

Membrane cellulaire

ADN

Noyau cellulaire

Chromatine

Nucléosomes

Cryomicroscopie

Mots clés libres

CEMOVIS

Cryo-microscopie électronique

Cryosections

Cryo-ultramicrotome

Particules Coeur de Nucléosome

Cellules HT29

Phase hexagonale

Bicouches

Film de carbone

Alliage titane-silicium

Micromanipulateur

CEMOVIS

Cryo-electron microscopy

Cryosections

Cryo-ultramicrotomy

Nucleosome Core Particle (NCP)

Chromatin

Nucleus

HT29

Désoxyribonucleic acid (DNA)

Hexagonal phase

Bilayers

Carbon films

Titanium-Silicon alloy

EELS

Electric conductivity

Micromanipulator

Résumé

Nous avons utilisé la méthode de CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy Of Vitreous Sections) pour étudier l’ultrastructure des cellules HT29 (lignée cancéreuse colique humaine) et plus particulièrement l’organisation de la chromatine au sein du noyau. Pour améliorer la méthode, nous avons développé un micromanipulateur qui facilite la collecte des coupes et leur transfert sur la grille. Nous avons également cherché à préparer de nouveaux films métalliques (en remplacement du carbone) permettant une meilleure adhésion des coupes sur le support Au vu des premiers tests réalisés, les films de TiO2 que nous avons fabriqués au laboratoire et caractérisés par microscopie électronique (HR, spectroscopie et cartographie EELS) semblent offrir des perspectives intéressantes que nous attribuons à leur propriétés de conducteur électrique à basse température (ce qui reste à démontrer). Les organites cellulaires (noyaux, réseaux de filaments du cytosquelette, systèmes multilamellaires) ont été identifiés in situ. Les conditions d’imagerie choisies nous ont permis d’obtenir une résolution permettant d’identifier les deux feuillets des bicouches membranaires. Dans le noyau, nous avons observé des motifs striés, distants de 2.7 à 3.5 nm que nous attribuons à la molécule d’ADN enroulée autour du cœur d’histones. Comparées aux images de phases denses de nucléosomes, ces images suggèrent que les nucléosomes (jamais identifiés in situ jusqu’à présent) présentent un ordre très local au sein de la chromatine, que nous discutons à la lumières des modèles polymériques actuels.

The ultrastructure of HT29 cells (human epithelial adenocarcinoma cell line) was studied by CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections) with a special emphasis on chromatin organization in the cell nucleus. We proposed methodological improvements for this technique:- We first developed a grid holding micromanipulator to facilitate both cryosections collect and deposition on carbon-coated TEM grids.- We also developed new metallic thin films (to replace carbon-base supports) to enhance the adhesion of cryosections on their support. The TiO2 thin films that we produced and analysed by electron microscopy (high resolution imaging, EELS and chemical mapping) seem to be an interesting alternative to carbon films for the deposition of cryosections. Their adhesive properties could be due to Titanium high electric conductance at low temperature (although this relation has not been clearly demonstrated yet).In HT 29 cells, we indentified cell organites (nucleus; cytoskeleton filament bundles, multilamellar bodies) in situ. Selected imaging conditions provide for a high enough resolution to visualise the two membrane leaflets. In the cell nucleus, we observed striated patterns separated from 2.7 to 3.5 nm that we assume to be DNA molecule turns wrapped around the histone protein core. Compared with the dense phases formed in vitro by nucleosome core particle in solution, our images suggest that nucleosomes are locally ordered in chromatin. This observation is discussed regarding the chromatin polymeric models.