Régulation de MtlR, activateur transcriptionnel de l’opéron mtl de Bacillus subtilis, par le domaine EIIB du transporteur du mannitol

Regulation of the Bacillus subtilis mannitol operon activator MtlR by EIIB domain

• Auteur / Autrice : Houda Zouiyed
• Direction : Josef Deutscher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et génétique moléculaire
• Date : Soutenance le 27/09/2012
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Gènes, Génomes, Cellules (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg) - Microbiologie et Génétique Moléculaire
• Jury : Président / Présidente : Suzanne Sommer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Josef Deutscher, Suzanne Sommer, Anne Galinier, Christophe Grangeasse, Harald Putzer
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Galinier, Christophe Grangeasse

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mannitol

Bacillus subtilis

Mots clés libres

Bacillus subtilis

L’opéron mannitol

MtlR

EIIBMtl

Séquestration à la membrane

Bacillus subtilis

Mannitol operon

MtlR

EIIBMtl

Membrane sequestration

Résumé

Chez Bacillus subtilis l’expression de l’opéron mtl pour l’utilisation du mannitol est contrôlé par MtlR. MtlR est un activateur transcriptionnel qui appartient à la famille des régulateurs DeoR composé d’un domaine HTH suivi de deux PRDs, un domaine EIIBGat et un domaine EIIAMtl-like.Le mécanisme général de la régulation de l’activité de MtlR est basé sur sa phosphorylation par des composants du PTS. La phosphorylation sur la Cystéine 419 du domaine EIIBGat par P~EIIAMtl a un effet négatif majeur sur l’activité de MtlR. Par conséquent, dans un mutant mtlF où EIIAMtl est délétée MtlR est constitutivement actif.Dans cette étude nous avons mis en évidence un nouveau phénomène de régulation de MtlR impliquant la protéine du PTS, EIIBMtl.Nous avons observé que lorsque on déléte l’opéron mtl ou EIIBMtl et EIIAMtl, l’activité constitutive de MtlR dans un mutant mtlF déjà observée est abolie d’où notre hypothèse que EIIBMtl aura un effet sur l’activité de MtlR. Par des expériences de double hybride nous avons montré une interaction directe, spécifique et bidirectionnelle entre les deux protéines EIIBMtl et EIIBGatEIIAMtl-like de MtlR. D’une manière comparable à la cellule où EIIBMtl est fusionnée à la protéine EIICMtl nous avons démontré que seulement la forme EIIBMtl fusionné à la perméase EIICMtl est capable d’activer MtlR mais nous avons également démontré que ce n’est pas EIICMtl qui est essentielle à l’interaction entre EIIBMtl et MtlR mais c’est le voisinage de la membrane qui est essentielle pour l’établissement de cette interaction et l’activation de MtlRUn modèle de régulation de l’activité du régulateur MtlR est proposé. Dans ce modèle l’induction de l’opéron mtl via l’activation de MtlR requiert la phosphorylation de PRDII de MtlR par P~His-HPr, la déphosphorylation de EIIBGat de MtlR par EIIAMtl et la présence de la forme non-phosphorylée de l’EIIBMtl qui est dominante en présence du substrat inducteur, le mannitol. Ainsi, l’EIIBMtl non-phosphorylée séquestre MtlR déphosphorylé sur sa cystéine 419 à la membrane, l’active et induit l’expression de l’opéron mtl.

The Bacillus subtilis mtl operon encodes the enzymes necessary for mannitol utilization. Its expression is controlled by MtlR, a transcriptional activator belonging to the DeoR family. MtlR contains a HTH domain followed by two PTS regulation domains (PRDs), an EIIBGat domain and an EIIAMtl-like domain.The general mechanism of the regulation of MtlR activity is based on its phosphorylation by components of the phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase system (PTS). The phosphorylation of EIIBGat on cysteine 419 by P~EIIAMtl has a major negative effect on the activity of MtlR. The absence of EIIAMtl in a mtlF mutant therefore leads to constitutively active MtlR.In this study a new mechanism of MtlR regulation based on the interaction of the PTS component EIIBMtl with MtlR is presented.We observed that the deletion of the entire mtlAFD operon or of mtlF and only the 3’-part of mtlA (encoding the EIIBMtl domain) abolishes the constitutive MtlR activity of the mtlF mutant, suggesting that MtlR activity depends on functional EIIBMtl. By carrying out yeast two-hybrid experiments we could establish a direct, specific and bidirectional interaction between EIIBMtl and the EIIBGatEIIAMtl-like part of MtlR.Complementation of the above mutants was possible with entire MtlA, but not with the EIIBMtl domain. EIIBMtl is normally fused to the membrane protein EIICMtl; we therefore fused EIIBMtl to another membrane, which indeed restored MtlR function in the absence of EIICMtl. The EIICMtl domain is therefore not essential for the interaction between EIIBMtl and MtlR; it is rather the vicinity of the membrane which is required for the activation of MtlR.A regulation model of MtlR activity is proposed. In this model, the MtlR-mediated induction of the mtlAFD operon requires the phosphorylation of PRDII by P~His-HPr and the dephosphorylation of EIIBGat by EIIAMtl. The presence of unphosphorylated EIIBMtl, which prevails when the inducer mannitol is present, is also required. Under these conditions unphosphorylated EIIBMtl sequesters MtlR dephosphoryled on cysteine 419, but phosphorylated at His-342, to the membrane thereby activating the transcription activator, which leads to increased expression of the mtlAFD operon.