Thèse soutenue

Contribution à l'étude des bases moléculaires des virus grippaux à potentiel pandémique dans l'environnement
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Auteur / Autrice : Amélie Dublineau
Direction : Jean-Claude Manuguerra
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Microbiologie et virologie
Date : Soutenance en 2012
Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

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L'étude de la survie des virus grippaux de type A dans le milieu extérieur est un élémen clé pour une meilleure compréhension de la transmission de ces virus et de leur écologie virale au sens large. Cela pourrait permettre d'anticiper les émergences d'une part, et d'aider les différentes autorités de santé à mettre en place des mesures d'hygiène et de protection individuelle. La survie virale hors de l'hôte peut varier d'un sous-type viral à l'autre et aussi au sein d'un même sous-type. La persistance du pouvoir infectieux au cours du temps a donc été étudiée pour 5 virus : 2 de sous-type H1N1, 1 de sous-type H3N2, et 2 de sous-type H5N1 hautement pathogène (HP). Les virus ont été exposés à plusieurs conditions environnementales et leur infectivité a été mesurée au cours du temps en utilisant la technique de titrage en dilution limite ou Dose Infectieuse en Culture Cellulaire 50% (DICC50). En milieu liquide, jusqu'à trois températures ont été testées : 4, 25 et 35 °C, combinées ou non à quatre concentrations en sel (0, 5, 35 et 270 g. L" 1). Pour les souches de sous-type H1N1, la survie virale a également été évaluée sur des surfaces lisses, en utilisant des verres de montre, à 4, 25 ou 35 °C. Dans l'eau, à 4 °C et sans sel, les virus ont persisté au moins 800 jours. L'augmentation de la température et de la salinité a un effet délétère important sur les virus, qui restent infectieux moins d'une journée à 35 °C et 270 g. L"1. Sur surface lisse, les virus restent infectieux au moins 7 jours à 35 °C et jusqu'à 66 jours à 4 °C. Les virus ont donc la capacité de résister dans l'eau et sur verre de montre pendant de longues périodes, même à 35 °C. La quantification du génome viral par RT-PCR quantitative en temps réel et la détection de génome intègre en RT-PCR en point final suggèrent que ce sont principalement les structures virales externes en contact direct avec l'environnement qui seraient impliquées dans la perte d'infectivité. Ces données observationnelles de persistance sont en accord avec les études publiées jusqu'à présent dans la littérature. A ce jour, une seule étude cible les déterminants moléculaires de la persistance des virus dans l'environnement. L'étude des déterminants moléculaires a été conduite en utilisant un modèle de pseudoparticules afin d'éviter le travail dans un laboratoire de niveau de confinement 3 et la production d'un grand nombre de virus mutés par génétique inverse. Les pseudoparticules lentivirales générées exprimaient la HA et la NA et ont été utilisées pour réaliser des cinétiques de survie en milieu liquide. La mise en place de ce système lentiviral a nécessité de nombreuses mises au point expérimentales et a été appliqué au sous-type A(H5N1). Les séquences de la HA et de la NA provenaient de la souche A/Thailand/1(Kan-1)2004 (H5N1). Le rôle potentiel de la N-glycosylation de la HA a été étudié en réalisant des mutations au niveau de sites potentiels de N-glycosylation. Des pseudoparticules mutées pour un seul site de N-glycosylation ont ainsi été produites. Le motif a été rendu non glycosylable en remplaçant l'asparagine (Asn) par une glutamine (Gin). Les résultats préliminaires obtenus suggèrent l'implication de la N-glycosylation dans la persistance observée des virus grippaux. D'autres plasmides doublement et triplement mutés pour la N-glycosylation ont aussi été produits, ainsi que des plasmides mutés au niveau de résidus principalement localisés à l'interface des deux sous-unités de la HA : HA! /HA2 et HA2/HA2. Cependant, l'étude de ces déterminants moléculaires nécessite d'être approfondie et élargie.