Biochemical and cellular analysis of the lysine and glutamic rich protein KERP1 : a virulence factor in the infection by Entamoeba histolyca

• Auteur / Autrice : Doranda Perdomo
• Direction : Nancy Guillén, Daniela Faust
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie, Génétique et Immunologie des Infections Parasitaires
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Trophozoïtes

Facteurs de virulence

Protéines du transport vésiculaire

Abcès amibien du foie

Dichroïsme circulaire

Entamoeba histolytica

Résumé

La protéine riche en lysine et acide glutamique KERP1 est un facteur de virulence chez Entamoeba histolytica, l'agent étiologique de l'amibiase, maladie infectieuse qui affecte l'intestin et le foie. KERP1 a été identifiée grâce à son affinité pour la bordure en brosse des entérocytes et à cause de son importance pour le développement d'abcès hépatique chez un modèle d'expérimentation animal. La caractérisation structurale de KERP1 par des expériences en dichroïsme circulaire et par ultracentrifugation analytique (AUC) nous ont permis de mettre en évidence son repliement en hélices alpha ainsi que sa haute stabilité à la dénaturation thermique, processus réversible et avec une Tm de 89. 6°C. D'autre part, la structure quaternaire a montré que KERP1 aurait une conformation en longs filaments qui forment des trimères. Des analyses en bioinformatique prédisent que cette protéine à une haute probabilité d'avoir un domaine superenroulé, données qui sont renforcées par celles concernant le coefficient de friction d'AUC. En utilisant un logiciel pour la modélisation de KERP1 en trois dimensions, nous avons conclu que le domaine superenroulé avait une importance pour la formation de trimère et pour la stabilité de KERP1. Avec ces informations, nous avons surexprimé le domaine superenroulé de KERP1 dans les parasites vivants et obtenu des transfectants qui pressentent un phénotype dominant négatif mesuré par leur diminution de 60% en la capacité d'adhérence aux cellules humaines. Des expériences d'immunoprécipitation couplées à des analyses en spectrométrie de masse ont permis d'identifier les partenaires intracellulaires de KERP1. Des protéines portant des domaines homologues à Alix (impliqué dans la formation d'endosomes tardifs), NSF (impliquée dans le trafic Golgien) et BAR (nécessaire à la courbure de membranes) signalent la présence de KERP1 dans le trafic vésiculaire chez l'amibe. Par ailleurs l'étude du transit de KERP1 dans l'amibe a mis en évidence des petites vésicules enrichies en KERP1 et qui sont libérés par le trophozoïte lors du contact avec des cellules humaines. C'est un phénomène jamais décrit auparavant qui suggère une interaction dynamique entre E. Histolytica et les cellules humaines dans laquelle KERP1 à un rôle important.

The lysine and glutamic acid rich protein KERP1 is a virulence factor in Entamoeba histolytica, the etiological agent of amoebiasis affecting two main organs in humans, the intestine and the liver. KERP1 has been found interacting with enterocytes and involved in the development of amoebic liver abscess, it is associated to the virulence process. The structural characterization of KERP1 was undertaken through circular dichroism analysis and by analytical ultracentrifugation (AUC) using a purified recombinant protein produced in Escherichia coll. Overall, KERP1 is an alpha helical rich protein, highly stable and reversible to thermal denaturation with a Tm of 89. 6°C and with a quaternary structure of a rod-like protein oligomerizing as a trimer. Bioinformatics analysis predicted that KERP1 have high probabilities to be folded as a coiled coil protein and the AUC frictional ratio correlates to such protein shape. The findings and the tertiary structure modeled for KERP1 revealed the coiled coil regions as a relevant domain for stabilization of KERP1. Parasites overexpressing the coiled coil domains of KERP1, display a dominant negative phenotype strain. These trophozoites demonstrated a 60% reduction in adherence to human cells linking KERP1 coiled coil domains to the role of E. Histolytica adherence. Immunoprecipitation experiments coupled to mass spectrometry proteomic analysis identified KERP1 partners in the amoeba, most of them involved in vesicle sorting between the Endoplasmic Reticulum and the Golgi apparatus. The newly identified factors include Alix (marker of late endosomes), NSF (marker of TGN traffic) and BAR (involved in membrane bending). Traffic of KERP1 in the parasite was observed once the trophozoites interacted with human cells by a microvesicle shedding mechanism from E. Histolytica, never described before. This phenomenon suggests a dynamic interplay between in E. Histolytica and human cells in which KERP1 has a relevant role.