Functional study of the interaction of rabies virus phosphoprotein with cellular protein FAK (focal adhesion kinase)

• Auteur / Autrice : Baptiste Fouquet
• Direction : Danielle Blondel-Maingonnat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie. Virologie fondamentale
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Focal adhesion protein-tyrosine kinases

Transcription génétique

Réplication virale

Corps d'inclusion viraux

Virus de la rage

Virus rabique

Protéine FAK

Résumé

Le virus de la rage est un virus à ARN simple brin de polarité négative codant pour 5 protéines virales dont la protéine P, le cofacteur de la polymérase. Un crible double hybride avec la protéine P a permis l'identification d'un partenaire cellulaire, la protéine FAK, qui constitue les complexes d'adhérence et est impliquée dans la régulation de différents processus cellulaires (survie, migration et cycle cellulaire). Nous avons confirmé l'interaction entre les 2 protéines par co-immunoprécipitation et colocalisation en microscopie confocale. Après avoir identifié que le domaine FRNK de FAK interagit avec les résidus 106 à 131 de P, des expériences de mutagénèse dirigée sur P ont permis de préciser les résidus clés (RI06, RI09 et RI 13) impliqués dans l'interaction avec FAK. Afin d'étudier le rôle de l'interaction P-FAK au cours du cycle viral nous avons construit, par génétique inverse, un virus de la rage possédant une protéine P avec le résidu RI09 muté en alanine qui ne peut plus interagir avec FAK. L'analyse des virus WT et mutant révèle que l'absence d'interaction avec FAK entraine une diminution de la quantité de protéines et d'ARNm viraux ainsi que de la production virale. De plus, FAK n'est plus localisée dans les corps de Negri du virus mutant, comme observé pour le virus WT, et parallèlement la morphologie et l'évolution de ces structures sont modifiées. Il n'y a en revanche pas de différences entre les 2 virus dans la régulation de divers processus cellulaire impliquant FAK. Ces résultats suggèrent un rôle proviral de FAK au niveau de la transcription et de la réplication virale, même si un rôle dans l'immunité innée contrecarré par P n'est pas à exclure.

The rabies virus is a single-stranded RNA virus of negative polarity encoding 5 viral proteins, which P protein, the cofactor of the polymerase. A two-hybrid screen with the P protein allowed the identification of a cellular partner, the protein FAK, which constitute the adhesion complexes and is involved in regulating various cellular processes (survival, migration and cell cycle). We confirmed the interaction between the two proteins by coimmunoprecipitation and colocalisatiçn by confocal microscopy. After identifying the FRNK domain of FAK interacts with residues 106-131 of P, site-directed mutagenesis experiments on P have clarified the key residues (RI06, RI09 and RI 13) involved in the interaction with FAK. To investigate the role of P-FAK interaction during the viral life cycle we have built, by reverse genetics, a rabies virus with a P with residue RI09 mutated to alanine, which cannot interact with FAK. Analysis of WT and mutant viruses revealed that the lack of interaction with FAK leads to a decrease in the amount of viral protein and mRNAs and viral production. In addition, FAK is no more localized in Negri bodies of the mutant virus, as observed for the WT virus, and parallel morphology and evolution of these structures are modified. There is however no differences between the two viruses in the regulation of various cellular processes involving FAK. These results suggest a proviral role of FAK in viral transcription and replication, although a role in innate immunity thwarted by P is not excluded.