Caractérisation fonctionnelle et génétique des domaines immunogènes de VAR2CSA contre le paludisme gestationnel

Functional and genetic Characterization of immunogenic domains of VAR2CSA against pregnancy associated malaria

• Auteur / Autrice : Bita Bordbar
• Direction : Philippe Deloron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Thérapeutiques Biotechnologiques
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vaccins contre le paludisme

Anticorps antiprotozoaires

Vaccination

immunologie

Plasmodium falciparum

Complications parasitaires de la grossesse

Résumé

La protéine VAR2CSA de P. Falciparum est le candidat principal pour le développement du vaccin contre le paludisme gestationneL Cependant, le haut poids moléculaire de VAR2CSA (350 kDa) ainsi que le taux élevé du polymorphisme du gène CAR2CSA sont deux éléments limitant dans la faisabilité du vaccin. L'identification d'une région minimale de VAR2CSA incluant des épitopes majeurs de VAR2CSA est nécessaire afin de pouvoir élaborer un vaccin protégeant les femmes enceintes contre le paludisme. Nombreuses études ont été réalisées sur ce sujet, parmi lesquelles une qui a été effectuée dans notre laboratoire et qui a mis en évidence, en accord avec d'autres études récentes, la localisation N-terminale (NTS-DBL1X-ld1-DBL2X) des épitopes protectifs contre le paludisme gestationneL Dans le premier article, nous avons montré que l'usage de la technique de vaccination génétique présentait de nombreux avantages pour réaliser la cartographie antigénique des protéines, en prenant exemple de la protéine VAR2CSA. Dans le deuxième article, nous avons zoomé sur les domaines N-terminal de VAR2CSA afin de minimiser autant que possible la région incluant les épitopes protectifs majeurs. Ainsi, nous avons réalisé une cartographie raffinée sur la partie N-terminale de la protéine VAR2CSA, en utilisant 5 constructions dérivées (NTS-DBL1X, NTS-DBL1X-ld1, Idl, ld1-DBL2X et DBL2X) du fragment NTS-DBL1X-Id1-DBL2X, pour l'immunisation génétique de souris via électroporation. Les anticorps produits en réponse à chaque construction ont été testés en ELISA puis par FACS pour vérifier leur réactivité avec la protéine recombinante et les hématies infectées. Finalement, ces anticorps ont été examinés pour leur capacité à bloquer la liaison des hématies parasitées aux CSA in vitro. Nous avons identifié ldl-DBL2X comme le fragment le plus court de la protéine VAR2CSA, hautement immunogène et capable de déclencher les anticorps qui bloquent l'adhésion des érythrocytes infectés au CSA, avec la même efficacité que les antisera anti-VAR2CSA extracellulaire. Nous avons également montré que les anticorps anti-ld1-DBL2X reconnaissent spécifiquement la surface des érythrocytes infectés provenant des isolats de femmes enceintes du Bénin et que ces anticorps inhibent jusqu'à 95% selon les isolats, l'adhésion de ces érythrocytes parasités au CSA. Enfin, le dernier volet de la thèse est dédié à la caractérisation de la diversité génétique du fragment ld1-DBL2X. Nous avons donc séquence le fragment du gène VAR codant pour la région ld1-DBL2X de la protéine VAR2CSA, sur environ 380 échantillons provenant des isolats naturels VAR2CSA de P. Falciparum collectés des régions géographiques où le paludisme s'est majoritairement développé : Bénin, Sénégal, Tanzanie, Madagascar, Afrique, Cambodge, Asie, Pérou, Amérique Latine, Papouasie Nouvelle Guinée et en Océanie.

VAR2CSA is considered as the main target of protective immunity against pregnancy-associated malaria. VAR2CSA high molecular weight complicates scaling up production of VAR2CSA recombinant protein for large-scale vaccination programmes. We previously demonstrated that antibodies induced by NTS-DBL1X-ld1-DBL2X efficiently block parasite binding to CSA in a similar manner to antibodies induced by the full-length extracellular part of VAR2CSA. This work aimed first at identifying the shortest fragment of VAR2CSA carrying major protective epitopes able to elicit inhibitory antibodies. To achieve this goal we performed a refined antigenic mapping of NTS-DBLlX-ld1-DBL2X through a DNA vaccination technique. Likewise, five single or double domains constructs encoding NTS-DBL1X, NTS-DBL1X-ld1, Id1, ld1-DBL2X and DBL2X were made and used to immunize mice. The NTS-DBL1X, NTS-DBLIX-ld1, and ldl-DBL2X fragments all raised high titer immune response, as measured by ELISA. The DBL2X fragment raised a weaker antibody titer, and the Id1 construct failed to elicit antibody. Sera from mice immunized with NTS-DBL1X or DBL2X constructs failed to block infected erythrocytes binding to CSA, whereas sera from mice immunized with NTS-DBLIX-ld1 showed partial inhibitory activity, and the ld1-DBL2X fragment elicited antisera that totally abrogated infected erythrocytes adhesion to CSA. IgG purified from ldl-DBL2X antisera showed a similar inhibitory profile than ld1-DBL2X antisera. Anti-FCR3 anti-ld1-DBL2X antibodies also efficiently block the adhesion of erythrocytes infected by the HB3 parasite line to CSA. Ld1-DBL2X antisera recognized the surface of field isolates from pregnant women, and inhibited CSA-binding of all 8 isolates tested, although to a variable level. We raised high-titer antibodies against several parts of the protein, and identified ldl-DBL2X as the minimal VAR2CSA fragment inducing antibodies with CSA-binding inhibitory efficiency in the same range as the full-length extracellular part of VAR2CSA. The second part of the work is dedicated to a global characterization of genetic diversity of id1-DBL2X fragment within eight Worldwide isolates of natural P. Falciparum populations coming from four continents. To perform this study, we have take advantage of Next Generation Sequencing (NGS). A moderate level of genetic differentiation is observed up to the position 569 of the nucleotide sequence, whereas a significant increase is observed in the following part of the fragment. Interestingly, this boundary nearly matches the separation between the Id1 and DBL2X domains. This means that on Id1 fragment the genetic differentiation between the eight populations is moderated while it become much more important on DBL2X level.