Modulation des fonctions des cellules inflammatoires par la galectine-3 et la jacaline

Modulação das funções de células inflamatòrias por galectina-3 e jacalina

• Auteur / Autrice : Clàudia Danella Polli
• Direction : Gabriela Silva Bisson, Lise Halbwachs-Mecarelli
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 6 en cotutelle avec Sao Paulo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Macrophages

Galectines

Neutrophiles

Résumé

Macrophages et neutrophiles associés aux tumeurs (TAM / TAN) ont des rôles ambigus et complexes dans le processus de la cancérogenèse, le phénotype de ces cellules pouvant être modulé par le microenvironnement de la tumeur. Plusieurs facteurs sont impliqués dans les interactions entre TAM / TAN et les cellules cancéreuses, comme les cytokines, les chimiokines et les facteurs de croissance et angiogéniques. Une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent les fonctions de TAM / TAN est cruciale pour pouvoir interférer avec la différenciation de ces cellules, en les orientant vers des phénotypes anti- tumoraux. Dans la première partie de cette étude, nous avons étudié le rôle de la galectine -3 (Gal-3) dans la régulation de l’inflammation. La galectine -3, une lectine endogène liant les β -galactosides, est localisée dans le cytoplasme ou en extracellulaire et sécrétée par diverses cellules inflammatoires. Les études avec des animaux déficients en Gal-3 soulignent le rôle crucial de cette lectine dans les réactions inflammatoires, mais, la Gal-3 ayant une distribution ubiquitaire, ces travaux ne peuvent pas distinguer les effets de la Gal-3 intracellulaire de celle extracellulaire. La modulation de la réponse des neutrophiles par Gal-3 a été décrite avec des résultats contradictoires concernant la nécessité de pré- activation des cellules. Dans notre étude, nous nous concentrons sur les effets extracellulaires de la Gal-3 sur les fonctions des neutrophiles humains. Bien que Gal-3 est fortement exprimé au niveau intracellulaire dans les neutrophiles, comme le montre l'analyse des lysats cellulaires par Western Blot, nous n'avons pas pu détecter Gal-3 sur la surface des neutrophiles au repos ou activés. Le Gal-3 exogène recombinante se liait aux neutrophiles par son domaine lectine (liaison inhibée par le lactose), et cette liaison était considérablement augmentée (60%) sur les neutrophiles activés par du fMLP. Nous avons observé par immunofluorescence une liaison homogène de la Gal-3 recombinante biotinylée aux neutrophiles conservés à 4° C. Le transfert des neutrophiles à 37 ° C a eu comme effet un regroupement de la Gal- 3 lié à la surface de la cellule (capping), avec une colocalisation de cette lectine avec les molécules CD66 (ligand connu de la galectine -3) et de CD43 (leucosialine), mais pas avec les molécules d'intégrine CD11b/CD18. Le liaison de Gal-3 déclenchait la dégranulation de neutrophiles, révélée par l'augmentation de l'expression de CD11b. Par ailleurs, la lectine était capable de potentialiser l'expression de CD11b induite par une concentration sous-optimale de TNF- α (1 ng / ml). Cependant, Gal-3 n'était pas capable de déclencher la production d'espèces réactives de l'oxygène par les neutrophiles, même après stimulation préalable avec le TNF- α. Enfin, Gal-3 était capable de déclencher l’adhérence des neutrophiles à la gelatine de manière dose-dépendante. Ces effets de la Gal 3 recombinante n'étaient pas dus à une contamination par du LPS, car la pré-incubation de Gal-3 avec de la polymyxine B ne modifiait pas sa capacité à activer les neutrophiles. Dans l’ensamble, nos résultats montrent que la Gal- 3 exogène active à la fois les neutrophiles naïfs et les neutrophiles activés, éventuellement par des interactions avec CD66 et CD43, confirmant les fonctions pro-inflammatoires de cette lectine. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons étudié la modulation de l'activité antitumorale des macrophages par la galectine -3 et la lectine végétale jacaline. Nous avons d’abord évalué l'effet direct de ces lectines sur des lignées cellulaires de cancer du côlon (HT- 29) et du sein (MCF- 7). Nous avons constaté que les lectines se liaient à la surface des cellules tumorales essentiellement par leurs domaines de reconnaissance de glucides (DGL), ces liaisons étant inhibées par des sucres spécifiques. La Gal-3 ou la jacaline n'affectaient pas la prolifération cellulaire tumorale, mesurée par le test de MTT. Les lectines se liaient à la surface des macrophages, également par les domaines DGL, induisant la production de cytokines par ces cellules. Le Gal-3 avait comme effet une augmentation de l'expression du TGF- β, tandis que la jacaline augmentait l'expression de TNF- α, TGF- β, IL- 1β et MIP- 1α. Les lectines ne modifiaient pas l'expression de CXCL8, CCL2, IL-10, IL- 12p35 et IL- 12p40. Des niveaux élevés de TNF et d'IL- 6, évalués par ELISA, ont été détectés dans les surnageants de macrophages stimulés avec la jacaline ou la Gal-3. Des niveaux élevés d'IL- 10 et IL- 1β ont également été détectés dans le surnageant de ces cellules. Toutefois, les lectines n'avaient pas d'effet sur la production de MMP9 et d'oxyde nitrique par les macrophages. Comme les cytokines pro-inflammatoires étaient principalement produites par les macrophages en réponse à la stimulation par Gal-3 ou jacaline, nous avons evalué si cela impliquait la voie de signalisation NF- kB. Nous avons observé que seule la jacaline était capable d'activer ce facteur de transcription. Ces résultats suggèrent que les lectines polarisent les macrophages vers un phenotype pro -inflammatoire anti- tumorale (M1). Ainsi, nous avons étudié l'activité antitumorale des macrophages stimulés par les lectines. L'incubation des cellules HT-29 ou MCF- 7 avec des surnageants de macrophages stimulés par la Gal-3 ou la jacaline entraînait une diminution de la viabilité de ces cellules, détectée par un test MTT. En plus, l'analyse par cytométrie de flux en utilisant l'annexine V a montré une apoptose des cellules tumorales. En résumé, ces résultats indiquent que Gal-3 et jacaline, par leurs activités pro-inflammatoires, peuvent diriger les macrophages vers un phénotype anti-tumorale.

Macrófagos e neutrófilos associados a tumores (TAMs/TANs) exercem papéis complexos e ambíguos no processo de carcinogênese, uma vez que os fenótipos dessas células podem ser modulados pelo microambiente tumoral. Diversos fatores estão envolvidos nas interações existentes entre TAMs/TANs e células cancerosas, como citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento e angiogênicos. Um melhor entendimento dos mecanismos que regulam as funções dos TAMs/TANs é de fundamental importância para podermos interferir na diferenciação dessas células, direcionando-as para fenótipos anti-tumorais. Na primeira parte deste trabalho, investigamos a capacidade de galectina-3 (Gal-3) induzir respostas imunomoduladoras. Galectina-3, uma lectina endógena ligante de β-galactosídeos, é expressa e secretada por diferentes células inflamatórias, podendo localizar-se tanto intra quanto extracelularmente. Ensaios in vivo com animais deficientes de Gal-3 enfatizam o papel crítico dessa lectina nas respostas inflamatórias, mas não permitem distinguir seus efeitos intracelulares dos extracelulares. A modulação de respostas neutrofílicas por Gal-3 tem sido descrita, apresentando resultados contraditórios em relação à necessidade de pré-ativação dessas células. No presente trabalho, focamos os efeitos extracelulares de Gal-3 exercidos sobre a função de neutrófilos humanos. Embora Gal-3 seja altamente expressa intracelularmente em neutrófilos, como demonstrado por análises de lisados celulares por western blot, não conseguimos detectar Gal-3 na superfície de neutrófilos em repouso ou ativados. Gal-3 recombinante exógena foi capaz de se ligar aos neutrófilos via seu domínio lectínico (ligação inibida por lactose) e essa ligação foi fortemente aumentada (60%) em neutrófilos ativados com fMLP. Observamos por imunofluorescência uma distribuição homogênea de Gal-3 biotinilada ligada a neutrófilos mantidos a 4°C. A transferência desses neutrófilos para 37°C resultou na indução de capping por Gal-3 ligada à superfície celular, a qual se colocalizou às moléculas CD66 (ligante conhecido de galectina-3) e CD43 (leucosialina), mas não às moléculas de integrina CD11b/CD18. Gal-3 induziu desgranulação de neutrófilos, demonstrada pelo aumento na expressão de CD11b. Além disso, a lectina foi capaz de potencializar a expressão de CD11b induzida por concentração sub-ótima de TNF-α (1 ng/ml). Entretanto, Gal-3 não foi capaz de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos, mesmo após estímulo prévio com TNF-α. Finalmente, Gal-3 induziu, de maneira dose-dependente, adesão de neutrófilos a poços recobertos com gelatina. A pré-incubação de Gal-3 com polimixina B não alterou sua capacidade de ativar neutrófilos, excluindo a ação de LPS contaminante. Esses resultados mostram que Gal-3 exógena ativa tanto neutrófilos naïve quanto ativados, possivelmente via interações com CD66 e CD43, confirmando suas funções pró-inflamatórias. Na segunda parte desse trabalho, investigamos a modulação de atividades tumoricidas de macrófagos por galectina-3 e pela lectina vegetal jacalina. Inicialmente, avaliamos o efeito direto dessas lectinas sobre linhagens celulares de câncer de cólon (HT-29) e de câncer de mama (MCF-7). Ambas lectinas se ligaram à superfície das células tumorais, principalmente via seus domínios de reconhecimento de carboidrato (CRD), uma vez que essas ligações são inibidas na presença de açúcares específicos. Gal-3 ou jacalina não afetaram a proliferação das células tumorais, como avaliado por ensaio de MTT. As lectinas se ligaram à superfície de macrófagos, também via CRD, e induziram a produção de citocinas por essas células. Gal-3 induziu aumento na expressão de TGF-β, enquanto jacalina induziu aumento na expressão de TNF-α, TGF-β, IL-1β e MIP-1α. Ambas lectinas não foram capazes de alterar a expressão de CXCL8, CCL2, IL-10, IL-12p35 e IL-12p40. Como avaliado por ELISA, altos níveis de TNF e IL-6 foram detectados no sobrenadante de macrófagos estimulados com Gal-3 ou jacalina. Aumento nos níveis de IL-10 e IL-1β também foi detectado no sobrenadante dessas células. Entretanto, as lectinas não afetaram a produção de MMP9 ou de óxido nítrico por macrófagos. Visto que citocinas pró-inflamatórias eram predominantemente produzidas por macrófagos em resposta a estímulos de Gal-3 ou jacalina, investigamos, então, se a via de sinalização NF-κB estava ativada nessas células. Observamos que apenas jacalina foi capaz de ativar esse fator de transcrição. Esses resultados indicam que as lectinas polarizam macrófagos para padrões pró-inflamatórios, com fenótipos antitumorais (M1). Dessa maneira, estudamos as atividades tumoricidas de macrófagos estimulados pelas lectinas. A incubação de células HT-29 ou MCF-7 com sobrenadante de macrófagos estimulados por Gal-3 ou jacalina resultou em redução da viabilidade dessas células, como detectado em ensaios de MTT. Ademais, análises de citometria de fluxo utilizando-se anexina V mostraram que a redução da viabilidade celular induzida por jacalina era resultante da apoptose das células tumorais. Em resumo, esses resultados indicam que Gal-3 e jacalina, por meio de suas habilidades de exercer atividades pró-inflamatórias, podem direcionar macrófagos para fenótipos antitumorais.

Tumor-associated macrophages and neutrophils (TAMs/TANs) have an ambiguous and complex role in the carcinogenic process as these cells can be polarized into different phenotypes by the tumor microenvironment. The interactions between tumor cells and TAMs/TANs involve several players such as cytokines, chemokines, and growth and angiogenic factors. A better understanding of the function and regulatory effects of TAMs/TANs is crucial to interfere with their differentiation in order to skew TAM/TAN polarization into cells with an anti-tumor phenotype. In the first part of this study, we investigated the ability of galectin-3 to induce immunomodulatory responses. Galectin-3, an endogenous beta-galactoside-binding lectin with both intracellular and extracellular localizations, is expressed and secreted by various inflammatory cells. In vivo experiments with galectin-3-/- mice emphasized the critical role of this lectin in inflammatory responses but did not allow distinguishing extracellular and intracellular effects. Modulations of polymorphonuclear neutrophil (PMN) responses by galectin-3 have been described, but with contradictory results regarding the need of neutrophil priming. In this work we focused on galectin-3 extracellular effects on human PMN functions. Although galectin-3 is highly expressed intracellularly in neutrophils, as shown by western blot analysis of cell lysates, we could not detect galectin-3 on the surface of resting or activated neutrophils. Exogeneous recombinant galectin-3 was able to bind to PMN via its lectin site (inhibited by lactose) and this binding was significantly increased (60%) when PMN were activated with fMLP. A homogeneous binding of biotinylated galectin-3 was observed by immunofluorescence on PMN at 4°C. Transfer to 37°C resulted in a capping of cell-bound galectin-3, which was co-localized with a known galectin-3 ligand, CD66 and with another major membrane glycoprotein, leucosialin CD43, but not with the CD11b/CD18 integrin. Galectin-3 triggered PMN degranulation, as shown by CD11b upregulation. Moreover, it was able to further enhance the CD11b up-regulation triggered by suboptimal TNF-α concentrations (1 ng/ml). However, galectin-3 was not able to induce oxidative burst on neutrophils, even after TNF-α priming. Finally, galectin-3 induced the adhesion of PMN to gelatin-coated plates in a dose-dependent manner. Galectin-3 preincubation with polymyxin B did not modify its ability to activate neutrophils, excluding an effect of contaminating LPS. These results show that exogenous galectin-3 activates both naive and primed PMN, possibly via an interaction with CD66 and CD43, thus confirming its pro-inflammatory function. In the second part of this study, we investigated the modulation of macrophage tumoricidal activities by galectin-3 (Gal-3) and the plant lectin jacalin. We first evaluated the direct effects of these lectins on human colon (HT-29) or breast (MCF-7) adenocarcinoma cell lines. Both lectins bound to the surface of tumor cells mainly through their carbohydrate recognition domains (CRD), since the binding was inhibited in the presence of specific sugars. Gal-3 or jacalin did not affect tumor cell proliferation, as evaluated by MTT assays. The lectins bound to the macrophage surface through their CRDs, and induced cytokine production by these cells. Galectin-3 augmented TGF-β expression, while jacalin augmented the expression of TNF-α, TGF-β, IL-1β and MIP-1α. Both lectins did not change the expression of CXCL8, CCL2, IL-10, IL-12p35 and IL-12p40. As measured by ELISA, high levels of TNF and IL-6 were detected in the supernatant from macrophages stimulated with Gal-3 or jacalin. Increased IL-10 and IL-1β levels were also detected in the supernatants from these cells. On the other hand, the lectins did not affect the production of MMP9 or nitric oxide by macrophages. Given that that pro-inflammatory cytokines were predominantly produced by macrophages in response to stimulation with Gal-3 or jacalin, we next investigated whether NF-κB signaling is activated by the lectins. We found that only jacalin was able to activate the transcription factor. The results obtained indicate that the lectins polarize macrophages towards the pro-inflammatory, anti-tumor M1 phenotype. Therefore, we studied the tumoricidal activities of lectin-stimulated macrophages. Incubation of HT-29 or MCF-7 cells with supernatants from macrophages stimulated with Gal-3 or jacalin resulted in a reduction of cell viability, as assessed by MTT assays. Furthermore, flow cytometric analysis using annexin V showed that the reduction of cell viability induced by jacalin was due to apoptosis of tumor cells. Taken together, these results indicate that galectin-3 and jacalin, through their ability to exert a pro-inflammatory activity, can direct macrophages to an anti-tumor phenotype.