Application de la spectrométrie de masse à l'identification et la quantification de peptides biomarqueurs

MS-based approaches for the identification and quantification of biomarker peptides

• Auteur / Autrice : Cédric Mesmin
• Direction : Éric Ezan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie. Chimie Analytique
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés contrôlés

Peptides cycliques

Marqueurs biologiques

Spectrométrie de masse

Mots clés libres

Srm

Résumé

L’intérêt de la communauté scientifique pour les biomarqueurs protéiques ne cesse de croître. Bien que la spectrométrie de masse (MS) se positionne de plus en plus comme un outil de choix pour leur analyse, les immunodosages (IA) restent le standard en clinique. Ce travail se propose d’évaluer l’apport de la MS pour l’identification et la quantification de deux biomarqueurs peptidiques. AcSDKP-NH2 est un candidat marqueur du débit de filtration glomérulaire, en cours d’étude clinique. Une méthode quantitative par LC-MS/MS a été développée et comparée avec un IA existant. Grâce à une extraction, une chromatographie, et un standard interne adaptés, la MS montre des performances analytiques légèrement supérieures. Appliquée à des échantillons de plasma/urine humains, la MS fournit des concentrations à l’équilibre intra-sujets plus stables. De plus, l’IA montre un effet matrice dans certains cas, dont ne souffre pas la MS. Ainsi, la MS apparait comme une alternative à l’IA pour le dosage clinique de l’AcSDKP-NH2. Les apelines sont des biomarqueurs putatifs de maladies cardiovasculaires. L’IA quantifie les cinq formes circulantes sans les discerner et avec une forte variabilité. Un dosage LC-MS/MS multiplexé rigoureux a été développé, et appliqué au plasma humain. De façon surprenante, aucune des formes attendues n’a été détectée. Des méthodes IA et MS ont été développées pour identifier des formes inconnues, sans succès. Cependant, 46 apelines ont été identifiées dans le colostrum bovin. Ainsi, nos résultats suggèrent des concentrations en apelines plasmatiques sub-femtomolaires et posent la question des formes immuno-réactives

Protein biomarkers have high therapeutic/financial impact. Mass spectrometry (MS) is emerging as a comprehensive tool for their structural/quantitative investigation. However, immunoassays (IA) remain the golden standards in the context of clinical trials. This work investigates the role of MS for the identification and the quantification of two biomarkers. AcSDKP-NH2 is a candidate marker of glomerular filtration rate, currently investigated in a clinical study. A quantitative LC-MS/MS assay was developed and compared with an existing IA. Thanks to sample preparation, chromatography and internal standard, MS shows slightly better analytical performances. Applied to human plasma/urine samples, MS allows greater steadiness in intra-subject concentrations during the infusion. Moreover, IA showed matrix effects in certain instances, overcame by MS. Thus, MS appears as an alternative/complement to IA for AcSDKP-NH2 assessment in a clinical context. Apelin peptides are putative biomarkers of heart failure. IA quantifies without discrimination and with a huge variability the five circulating forms, preventing meaningful clinical investigation. A rigorous multiplexed LC-MS/MS assay was therefore developed, and applied to human plasma. Surprisingly, the expected circulating forms were not detected. Alternative MS and IA approaches were developed but did not fully succeed in identifying other unexpected circulating apelin peptides. However, 46 apelin peptides were identified by MS in bovine colostrum. Altogether, our results suggest sub-femtomolar concentrations of apelin peptides in human plasma, and ask for precise characterization of the immuno-reactive forms