Nouvelle stratégie de véctorisation d'antibactériens via des métallodrogues : Principe, Synthèse et Activité biologique

New antimicrobial vectorization strategy via metallodrugs : principle, synthesis and biological activity

• Auteur / Autrice : Mickaël Alimi
• Direction : Isabelle Artaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 30/11/2012
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, environnement (Paris ; 2010-2013)
• Jury : Président / Présidente : Marie-Christine Lallemand
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Artaud, Marie-Christine Lallemand, Marius Réglier, Dominique Mandon, Clotilde Policar, Jean-Marie Pagès
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Marius Réglier, Dominique Mandon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules -- Perméabilité

Acides hydroxamiques

Composés organométalliques

Antibactériens

Mots clés libres

Oxadiazole

Acide hydroxamique

Peptides antimicrobiens

Sonde fluorescente

Métallodrogue

Perméabilité membranaire

Efflux

Agent antibactérien

E. coli

Oxadiazole

Hydroxamic acid

Antimicrobial peptides

Fluorescent probe

Metallodrug

Membrane permeability

Efflux

Antimicrobial agent

E. coli

Résumé

L'enveloppe cellulaire des bactéries à Gram négatif constitue la première ligne de défense contre les antibiotiques. Sous l’effet, d’une part, de la faible perméabilité de la membrane externe qui s'oppose à la pénétration des agents antibactériens, d’autre part des pompes d'efflux qui favorisent leur expulsion, elle empêche nombre de composés potentiellement actifs in vitro d'atteindre leur cible, limitant l’effet antibactérien. Un enjeu important pour restaurer l’activité de ces molécules est de trouver une stratégie pour en augmenter la concentration intracellulaire. L'objectif de cette thèse est de développer des métallodrogues comme nouvelle stratégie de vectorisation de drogues dans les cellules. Cette stratégie repose sur l’association d'une drogue active in vitro, et d’un ligand auxiliaire ayant des propriétés perméabilisantes ou inhibitrices de pompe d’efflux, dans un complexe qui jouera le rôle de chaperone. Les agents antibactériens utilisés sont des inhibiteurs (dérivés d’acides hydroxamiques) de peptide déformylase (PDF) et de méthionine aminopeptidase (MetAP) développés au laboratoire. Tout d’abord, une étude globale de la stratégie de vectorisation a été réalisée (i) étude de stabilité de métallodrogues modèles : en utilisant un acide hydroxamique fluorescent, nous avons montré que, seules, des métallodrogues à Co(III), à la différence de celles à Cu(II) et Fe(III), satisfaisaient aux conditions de stabilité compatibles avec les conditions de tests biologiques. (ii) Etude de la libération de la drogue : nous avons établi par une étude RMN 1H et UV-vis qu’en milieu tampon pH = 7,4, la libération de la drogue se faisait par échange de ligand avec un thiol exogène. Récemment, une nouvelle série d’inhibiteurs de PDF a été synthétisée au laboratoire. Elle est basée sur un squelette hétérocyclique à 5 chaînons fonctionnalisé par une chaîne en C4, puis via un espaceur monocarboné, à un acide hydroxamique. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un oxadiazole (AT002 16 µg/ml sur E. coli en présence de perméabilisant PMBN). Au cours de cette thèse, pour améliorer la lipophilie, des groupements aromatiques ont été fixés sur cet hétérocycle. Les MICs sur la souche d’E. coli sauvage n’ont pas été améliorées mais en présence de PMBN, le dérivé présentant la meilleure activité est le composé AT015 (2 µg/ml sur E. coli en présence de PMBN) qui a donc été choisi pour concevoir des métallodrogues. La métallodrogue réunit autour d’un métal deux parties: (i) un ligand auxiliaire fonctionnalisé via un espaceur par un perméabilisant peptidique analogue de peptide antimicrobien ou par un modulateur de l’efflux (ii) un acide hydroxamique inhibiteur de PDF. Au cours de la SAR réalisée en faisant varier la drogue, le ligand auxiliaire et le métal, nous avons montré que les meilleures métallodrogues permettent d’améliorer l’activité de la drogue sur la souche d’E. coli sauvage d’un facteur 16. Un des ligands auxiliaires fonctionnalisé par un tétrapeptide présente, seul, une activité sur une souche d’E. aerogenes résistante aux fluoroquinolones. Sur ce cas, l’activité biologique a été reliée, par des expériences de mapping par fluorescence, à son accumulation intracellulaire, en utilisant un analogue fluorescent de ce composé.

The gram negative bacterias’ cell envelopes are the first line of defense against antibiotics. First thanks to the low permeability of the external membrane that prevents the penetration of the antibiotics, but also thanks to the efflux pumps that help expelling the antibiotics from the cell. These mechanisms prevent many compounds, potentially active in vitro, from reaching their targets, thus limiting the antimicrobial effect. To increase the molecules’ intracellular concentration is one of the means to restore their activity. This thesis’ objective is to develop metallodrugs as a new drug vectorization strategy in cells. We here associate an active drug in vitro and an auxiliary ligand with permeabilization or efflux pumps inhibition abilities in a complex playing the role of a chaperone. We used peptide deformylase (PDF) and methionine aminopeptidase (MetAP) inhibitors (derived from hydroxamic acids) developed at the laboratory as antimicrobial agents. I’ll begin with a global study of the vectorization strategy we’ve adopted (i) Stability study of the metallodrugs models: using a fluorescent hydroxamic acid, we showed that only Co(III) metallodrugs are in agreement with the stability conditions compatible with the biological tests, in opposition with the Cu(II) and Fe(III) ones. (ii) Drug release study: we showed in 1H NMR and UV-vis studies that in a buffer solution pH 7.4, a ligand exchange with an exogenous thiol is responsible for the drug release. Recently, a new series of PDF inhibitors was synthesized at the laboratory. It is composed of a 5 membered heterocyclic skeleton functionalized by a chain in C4 followed by an hydroxamic acid via a monocarbonated spacer. The best results were obtained with an oxadiazole (AT002 16 µg/ml with E. coli and PMBN as permeabilizing agent). During this thesis, to enhance lipophilicity, we attached aromatic groups on the heterocycle. CMIs on the E. coli strain have not been increased but the compounds displaying the best activity in presence of PMBN (AT015, 2 µg/ml with E. coli and PMBN) was chosen to conceive metallodrugs. The metallodrug is composed of a metal center and two other parts: (i) an auxiliary ligand functionalized via a spacer by a permeabilizing peptide, an antimicrobial peptide analogue, or by an efflux modulator. (ii) An hydroxamic acid PDF inhibitor. We showed that the best metallodrugs enhance the drug activity on the wild E.coli strain by a 16 factor, with the SAR we realized, changing the drug, the auxiliary ligand and the metal. One of the auxiliary ligands functionalized by a tetrapeptide show an activity on a fluoroquinolone-resistant E. aerogenes strain while alone. Utilizing a fluorescent analogous of this compound, we linked the biological activity to its intracellular accumulation with fluorescence mapping experiments.