Rôle du gène homéotique Otx2 dans la rétine adulte de souris

Function of the homeotic gene Otx2 in the mouse adult retina

• Auteur / Autrice : Michael Housset
• Direction : Thomas Lamonerie
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcriptome

Thérapie génique

Photorécepteurs (molécules)

Partie pigmentaire de la rétine

Dégénérescence rétinienne

Gènes homéotiques

Résumé

Le dysfonctionnement progressif et la dégénérescence des photorécepteurs de la rétine sont à l’origine de la majorité des cécités de l’adulte dans les pays industrialisés. De nombreuses altérations génétiques à l’origine des formes monogéniques et complexes de dégénérescence ont été identifiées, mais n’expliquent que la moitié des cas. Certaines concernent des gènes contrôlant le développement, et dont l’expression perdure dans la rétine mature. Leurs fonctions tardives sont encore très mal connues. C’est le cas du gène Otx2. Ce gène code un facteur de transcription à homéodomaine qui apparaît essentiel depuis la formation de la vésicule optique jusqu’à la maturation des cellules bipolaires et des photorécepteurs. Plusieurs mutations associées à des anomalies oculaires graves, dont la rétinite pigmentaire, ont été décrites chez l’homme. Pourtant, on ignore tout du réseau génétique qu’il contrôle. Les travaux que nous avons menés dans le cadre de cette thèse visent à comprendre les fonctions du gène Otx2 dans la rétine mature de souris. Ce gène est exprimé dans trois types cellulaires : l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE), les photorécepteurs et les cellules bipolaires. Son ablation, exclusivement restreinte à ses domaines d’expression (self-KO), a été induite chez l’adulte grâce à des lignées de souris créées au laboratoire. Le système est extrêmement efficace : Otx2 est détruit dans plus de 95% des cellules qui l’expriment. Ceci entraîne une dégénérescence progressive et exclusive des photorécepteurs par apoptose, qui commence 20 jours après le KO, et culmine à 30 jours. Au bout de quatre mois, la totalité des photorécepteurs a disparu. Ce modèle génétique est unique, car il offre un contrôle temporel précis. Surtout, i donne la possibilité d’observer la phase précédant la mort des photorécepteurs. C’est pendant cette phase infra-clinique que se manifestent les conséquences primaires de la perte de fonction d’Otx2. Nous avons utilisé cet avantage pour réaliser une étude cinétique du transcriptome rétinien au décours d’invalidation. Cette analyse a permis d’identifier 71 gènes dont l’expression est modifiée par l’invalidation d’Otx2. La variation de 37 de ces gènes a été validée par RT-qPCR. Parmi eux, une majorité montre une cinétique très fortement corrélée à la disparition d’Otrx2, et représente des cibles directes potentielles. Des gènes associés au stresse cellulaire sont induits après un délai de quelques jours, révélant un dépassement des cellules à faire à ce changement. Sur le plan fonctionnel l’enregistrement de l’activité rétinienne indique que les cellules du RPE présentent rapidement des anomalies de polarisation suivant le self-KO. Cette observation, ajoutée à des données d’histologie et d’expression, suggère fortement une origine non autonome de la dégénérescence des photorécepteurs, et qui serait liée principalement au dysfonctionnement du RPE. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons déclenché une invalidation du gène Otx2 exclusivement dans les cellules du RE de la rétine adulte à l’aide d’infections lentivirales topiques. Cette expérience reproduit le syndrome neurodégénératif du modèle de self-KO. Réciproquement, l’expression spécifique d’Otx2 dans le RPE de rétine self-KO prévient de manière efficace la dégénérescence des photorécepteurs. Ainsi, parmi les fonctions dirigées par Orx2 dans la rétine adulte, celles du RPE sont nécessaires et suffisantes au maintien des photorécepteurs. Le séquençage massif de la chromatine de RPE immunoprécipitée par Otx2 nous a permis d’identifier 24 gènes directement régulés. Ces gènes remplissent des fonctions nécessaires à l’homéostasie du RPE telles que la mélanogenèse, le métabolisme des rétinoïdes, la régulation du PH ou la concentration de métaux. Ils constituent d’excellents candidats pour les formes monogéniques et complexes de dégénérescence des photorécepteurs de type non autonome.

The major cause of adult blindness in industrialized countries is the progressive dysfunction and death of retinal photoreceptors. Mutations involved in both hereditary and complex forms of degeneration have been identified. Yet, a significant part of hereditary forms still misses genetic explanation and the number of loci that influence susceptibility to age-related macular degeneration (AMD) is expanding. Several genes involved in photoreceptor degeneration play key functions during development. Although their expression is maintained in the mature retina, their function is poorly known. Among these, Otx2 gene encodes a homeobox transcription factor essential for eye development, from eye territory patterning to photoreceptor and bipolar cell maturation. In human, several mutations in Otx2 locus have been associated to ocular malformation and occasionally to retinitis pigmentosa. In spite of its importance, Otx2 downstream molecular network is poorly defined. This work aimed to elucidate Otx2 functions in the mouse mature retina. In this tissue, Otx2 is found in the nucleus of RPE, photoreceptors, and bipolar cells. To explore its functions at a late stage, we took advantage of a model coined Otx2 self-KO, which allows time-controlled and efficient knockout of Otx2 only in cells that express it. Otx2 deletion leads to a relatively slow, still complete, photoreceptor degeneration by apoptosis starting 20 days after Otx2 ablation, and reaching a peak after 30 days. After 4 months, all photoreceptors have disappeared. Time-monitored gene ablation allows access to the period preceding photoreceptor degeneration, in which primary consequences of Otx2 self-KO occur. To shed light on the early molecular events leading to photoreceptor denegation, we analyzed the retina and RPE transcriptome using DNA microarrays at 0, 2, 4 an d8 days following Otx2 ablation? We identified 71 deregulated genes after Otx2 self-KO among which 37 were confirmed by RT-qPCR. Most of deregulated genes demonstrated a kinetic strongly correlated to Otx2 clearance, likely representing direct targets. After a 4 day delay, genes associated with cell stress signalling were induced, uncloaking cellular response to primary perturbation.