Thèse soutenue

Etude de l'activité enzymatique du facteur de terminaison de la transcription Rho avec une technique de nano-manipulation à l'échelle de la molécule unique
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Auteur / Autrice : Veronika Gocheva
Direction : Emmanuel MargeatMarcelo Nollmann
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie Santé
Date : Soutenance le 18/12/2012
Etablissement(s) : Montpellier 2
Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; ....-2014)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Biologie Structurale (Montpellier)
Jury : Président / Présidente : Catherine Royer
Examinateurs / Examinatrices : Emmanuel Margeat, Marcelo Nollmann, Catherine Royer, Vincent Croquette, Achillefs N. Kapanidis, Marc Boudvillain
Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Croquette, Achillefs N. Kapanidis

Mots clés

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Résumé

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La protéine Rho est une hélicase homohéxamérique en forme d'anneau responsable de la terminaison de la transcription chez les prokaryotes. Son activité est essentielle pour la régulation des gènes chez E.coli mais aussi chez d'autres bactéries. Le modèle classique de la terminaison de la transcription induite par Rho propose que ce processus soit initié par la fixation spécifique de Rho sur un site Rut (pour « Rho-utilization ») de l'ARN en cours d'élongation. Rho se lie sur le Rut via son site primaire de liaison (PBS) distribué parmi les domaines N-terminaux à travers l'anneau héxamérique. Par la suite l'ARN en cours de transcription est introduit dans le canal central de l'anneau où des contacts avec le site secondaire de liaison (SBS) s'effectuent. Ceci active l'activité enzymatique de la protéine et la translocation ATP-dépendante sur l'ARN en cours d'élongation dans la direction 5'-3', aboutissant à la dissociation de l'ARN polymérase et la terminaison de la transcription. Malgré le grand nombre de données structurales, biochimiques et génétiques, les mécanismes moléculaires employés par Rho pour effectuer ses fonctions biologiques restent peu connus et plusieurs aspects de ce modèle classique sont flous. Ceci inclut les étapes d'activation, le mécanisme de terminaison de la transcription (dissociation de l'ARN polymérase) et les mécanismes précis de translocation. Plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer les différents détails mécanistiques de l'activité enzymatique de Rho. Il est impossible de distinguer parmi ces modèles en utilisant des méthodes classiques d'ensemble car l'activation du complexe Rho-RNA est lente et donc constitue une étape cinétiquement limitante. D'où la nécessité d'expériences réalisées à l'échelle de la molécule unique pour une analyse quantitative de mécanismes moléculaires de Rho. La première partie de ces travaux de thèse a été le développement des outils requis pour l'observation de l'activité de la protéine Rho à l'échelle de la molécule unique. Un premier développement a été le design et la synthèse de constructions complexes en acides nucléiques adaptées à ce type d'étude. Elles sont composées d'une région simple brin d'ARN contenant la séquence d'un terminateur naturel de Rho (avec ou sans des structures en tige-boucle) et des « handles » en ADN/ARN nécessaires pour un attachement ultérieur des constructions. Par la suite, j'ai implémenté un montage de pinces magnétiques à haute résolution. Ceci a nécessité le développement et l'optimisation de ce montage mais également des programmes d'analyse des données. Ce montage a été par la suite utilisé pour étudier l'activité de la protéine Rho à l'échelle de la molécule unique. D'abord, en utilisant une stratégie basée sur une analyse en temps réel des données, j'ai optimisé les conditions expérimentales précises pour l'observation de l'activité de Rho avec des pinces magnétiques. Par la suite, j'ai utilisé ces conditions, dans une stratégie d'observation en parallèle de plusieurs constructions attachées pour augmenter les statistiques des événements observés. J'ai utilisé ce type d'essai pour observer pour la première fois la translocation de molécules uniques de Rho et mesurer leur processivité et vitesse de translocation. De plus, cette méthodologie m'a permis de distinguer parmi trois modèles proposés pour expliquer le mécanisme de translocation de Rho.