Thèse soutenue

Etude du protéasome "ancestral" HslVU de Leishmania major
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Auteur / Autrice : Ndeye Mathy Kebe
Direction : Olivier Coux
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie Santé
Date : Soutenance le 11/12/2012
Etablissement(s) : Montpellier 1
Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; ....-2014)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche de Biochimie Macromoléculaire (Montpellier)
Jury : Président / Présidente : Paul Mangeat
Examinateurs / Examinatrices : Olivier Coux, Paul Mangeat, Bruno Franzetti, Gilles Lalmanach, Michel Pagès
Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Franzetti, Daniel Taillandier

Résumé

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HslVU est une protéase dépendante de l'ATP découverte initialement chez certaines bactéries, et considérée comme une forme ancestrale du protéasome. Elle est constituée par l'association de deux sous-complexes : la protéase HslV, formée elle-même de deux anneaux hexamériques de la sous-unité HslV, et l'ATPase HslU, un hexamère de la sous-unité HslU, qui active l'activité peptidasique de HslV en s'associant à l'une ou à ses deux extrémités. HslVU a été identifiée dans la mitochondrie de protozoaires parasites, dont ceux de la famille des trypanosomatidae comme Leishmania major (agent de la leishmaniose) et Trypanosoma brucei (agent de la maladie du sommeil). Différents travaux ont montré que, chez T. brucei, l'inactivation d'HslVU par interférence ARN conduit à l'arrêt de la division cellulaire et à la mort du parasite. Puisqu'elle est absente chez l'homme, HslVU constitue donc une cible thérapeutique potentielle intéressante pour lutter contre ces parasites. Dans le cadre d'un projet collaboratif, le but de ma thèse était de caractériser la protéase HslVU de Leishmania major (LmHslVU), et de tester l'intérêt d'exploiter la symétrie de HslV pour développer des inhibiteurs empêchant la formation du complexe HslVU en se fixant à l'interface HslV/HslU. Dans ce contexte, ma thèse s'est développée autour de 3 axes principaux : (i) Production et caractérisation biochimique de LmHslV recombinant. J'ai montré que le complexe LmHslV seul est inactif, contrairement à son homologue bactérien qui a une activité basale même sans HslU, et qu'il peut être activé par des peptides synthétiques correspondant à l'extrémité C-terminale de son régulateur HslU, comme HslV d'E.coli et d'H.influenzae. Cela m'a permis de développer un test de l'activité peptidasique de LmHslV in vitro, miniaturisable pour un futur criblage de banques de molécules chimiques. La protéase LmHslV a également été caractérisée en testant l'effet de différents inhibiteurs de protéases sur son activité. Ce travail m'a également permis de montrer que l'activité peptidasique de HslV est très sensible à la présence d'ions Mg2+ dans les tampons d'activité, ce qui suggère qu'il existe des régulations allostériques des sites actifs de la protéase. (ii) Exploiter la symétrie de HslV pour développer des interacteurs multivalents de HslV. Nous avons cherché à vérifier expérimentalement si le fait d'utiliser des molécules multivalentes, c'est à dire possédant plusieurs sites d'interaction à HslV, permettait d'augmenter sensiblement l'affinité de ces molécules. Une molécule pentamérique, le « peptabody », capable de se fixer sur LmHslV via cinq sites d'interaction potentiels et agissant comme un inhibiteur de l'activité peptidasique de HslV, a été développée.(iii) Caractérisation du mode d'activation de LmHslV. Nous avons réalisé en collaboration des expériences de microscopie électronique sur LmHslV, qui ont révélé une possible rotation des deux anneaux de LmHslV liée à l'activation de la protéase. Cette rotation est spécifique de LmHslV puisqu'on ne l'observe pas chez HslV d'E. coli. La confirmation de ces résultats encore préliminaires est en cours.