Optimisation de l’activité de l’alpha-galactosylcéramide, ligand des lymphocytes T Natural Killer invariants

Optimization of alpha-galactosylceramide activity, ligand of invariant Natural Killer T lymphocytes

• Auteur / Autrice : Élodie Macho Fernandez
• Direction : François Trottein, Christelle Faveeuw
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 30/11/2012
• Etablissement(s) : Lille 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anergie clonale

Nanoparticules

Cellules T tueuses naturelles

Dissertations académiques

Cellules dendritiques

Nanoparticules

Cellules dendritiques

Mots clés libres

Alpha-galactosylcéramide (

Vectorisation

Lymphocyte NKT invariants (iNKT)

Résumé

Le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie représente de nos jours un enjeu majeur de santé publique. Dans ce contexte, les lymphocytes T Natural Killer invariant (iNKT) exercent de puissantes activités immuno-modulatrices. Ces cellules ont la particularité de reconnaitre par l’intermédiaire de leur récepteur T (TCR), des (glyco) lipides, présentés par la molécule CD1d exprimée par les cellules présentatrices d’antigènes (APC), notamment les cellules dendritiques (DC). Initialement découvert à partir d’une éponge marine pour ses activités anti-métastatiques, l’alpha-galactosylcéramide (a-GalCer ou KRN) induit rapidement une sécrétion massive, par les cellules iNKT, de cytokines immunomodulatrices telles l’IFN-g, conduisant à la transactivation de nombreuses cellules immunitaires, notamment les cellules Natural Killer (NK), les DC ou encore les lymphocytes Tgd. Cette propriété unique permet aux cellules iNKT de contrôler, chez la souris, le développement des réponses immunes, notamment la réponse anti-tumorale. Face à ces résultats encourageants, des essais cliniques chez l’homme ont été réalisés mais les résultats se sont avérés décevants. Actuellement, il existe deux stratégies pour cibler un antigène à une population cellulaire particulière : 1) le ciblage passif, basé sur la taille des particules ou leur composition et 2) le ciblage actif, basé sur les fortes interactions anticorps/antigène ou ligand/récepteur. Nous avons testé les deux types de ciblages et avons utilisé le même polymère pour constituer nos vecteurs : le PLGA ou poly(lactic coglycolic acid). Dans une première étude (ciblage passif), nous avons comparé l’efficacité de l’encapsulation de l’a-GalCer dans des particules de tailles différentes: des nano (NP) et microparticules (MP). L’a-GalCer vectorisé dans les NP et les MP est endocyté par les DC (voie des clathrines) et active les cellules iNKT in vitro et in vivo mais ne peuvent empêcher leur anergie. Ces résultats décevants nous ont conduits à opter pour le ciblage actif des DC. Dans un premier temps, étant donné les études controversées sur le rôle des DC dans l’anergie des cellules iNKT, nous avons revisité l’implication de ces dernières dans la primo-activation/anergie des cellules iNKT. Nous confirmons ainsi le rôle primordial de DC dans la primo-activation des cellules iNKT mais surtout, nous montrons qu’elles n’induisent pas leur anergie. Représentant une population hétérogène, nous montrons que parmi les DC, les DC CD8a+ sont de puissantes activatrices des cellules iNKT. Nos résultats nous ont ainsi menés à délivrer spécifiquement l’a-GalCer aux DC CD8a+. Pour cela, nous avons greffé sur les NP de PLGA un anticorps anti-DEC205, récepteur lectinique fortement exprimé par les DC CD8a+. In vitro et in vivo, les NP/DEC205/a-GalCer induisent une plus forte activation des cellules iNKT comparativement à l’a-GalCer libre. De même, la co-délivrance d’a-GalCer et d’ovalbumine (OVA) au sein des DC CD8a+ améliore les propriétés adjuvantes de l’a-GalCer en induisant des réponses humorale et cellulaire (lymphocytes T CD8+) spécifiques de l’OVA plus importantes comparativement à la délivrance des deux composés sous leur forme libre. Finalement, de façon intéressante, nous montrons que suite à une primo-activation par les NP/DEC205/a-GalCer, les cellules iNKT sont capables de répondre de nouveau à une seconde stimulation, traduisant l’absence d’anergie des cellules iNKT. En conclusion, nos résultats indiquent que la délivrance spécifique de l’a-GalCer aux DC CD8a+ amplifie la primo-activation des cellules iNKT tout en évitant la mise en place du phénomène d’anergie et ouvrent de nombreuses perspectives dans le cadre de thérapies anti-tumorales et anti-infectieuses.

Nowdays, the development of new immunotherapy strategies represent a major issuein public health. In this context, the invariant Natural Killer T lymphocytes (iNKT) have strongimmunomodulatory properties. This cell population recognizes (glycol)lipid presented by theCD1d molecule expressed by antigen presenting cell (APC) as dendritic cells (DC). Initiallyfound in a marine sponge for its anti-metastatic activities, alpha-galactosylceramide (-GalCer or KRN) induces a massive cytokine production (IFN-, IL-4, IL-17) by iNKT cells.This cytokine burst lead to downstream activation of numerous immune cells like naturalkiller cell (NK), DC or CD8+ T cells. Through this property, iNKT cells regulate numerousimmune responses, including anti-tumoral response. Based on encouraging results in themouse model, -GalCer has been used in anti-tumour therapy in human. Although the drugwas well tolerated, no or moderate clinical responses were observed in patients repeatedlyinoculated with -GalCer. As observed in the mouse system, one potential explanation forthis disappointing observation may lie in the induction of a long-term anergy of human iNKTcells, thus preventing cytokine release upon a recall stimulation. Although controversial,various studies suggest that this phenomonen should be due to a lack of delivery of -GalCer into dendritic cells (DC) and so its presentation by non adequate antigen presentingcell (APC) as B cells. The objective of our work was to optimize -GalCer activity by avoidingiNKT anergy using vectorisation approach. Actually, there are 2 strategies using nanotechnologies to target an antigen to a specific cell population: 1) passive targeting based on the size of the particles, their composition and their surface charge and 2) active targeting based on the strong interactions between an antibody and its antigen or a ligand and its receptor. We have tested the two strategies and therefore we use the same composition of our particles: PLGA or poly(lactic co glycolic acid). This biodegradable and biocompatible molecule is already used in therapy.In a first study (passive targeting), we compared the efficiency of -GalCer encapsulation inparticles with different size: nano (NP) and microparticle (MP). Vectorised -GalCer in NPand MP rapidly activates iNKT cells in vitro. Both type of particles are uptake by DC via aclathrin dependent mechanism. In in vivo approaches, NP/-GalCer and MP/-GalCeractivate iNKT cells but unfortunately could not prevent iNKT cell anergy. These disappointingresults led us to use an active targeting. In first time, because of controversial role of DC iniNKT anergy, we have revisited the role of DC in iNKT primo-activation and anergy. Weconfirm the primordial role of DC in iNKT primo-activation but especially we show that DC donot induce iNKT anergy. DC are heterogeneous and we show that among DC, CD8a+ DCsubpopulation are potent iNKT cells activation. Our results led us to deliver specifically a-GalCer to CD8+ DC. For this, anti-DEC205 antibodies were covalently linked to the surfaceof PLGA NP, DEC205 being highly expressed by CD8+ DC. In vitro and in vivo,NP/DEC205/-GalCer induce a stronger iNKT cell activation relative to free -GalCer (or NPIgG/-GalCer). Moreover, -GalCer and ovalbumin co-delivery in CD8+ DC improve -GalCer adjuvanticity leading to more important humoral and cellular responses. Interestingly,after a primo-activation by NP/DEC205/-GalCer, iNKT cells are able to respond to secondstimulation thus avoiding iNKT cell anergy.In conclusion, our results indicate that specific -GalCer delivery to CD8+ DC improve iNKT cells primo-activation and avoid anergy phenomenon. These findings open several perspectives in anti-tumoral and anti-infectious therapies.