Etudes par RMN des L,D-transpeptidases bactériennes : structure, dynamique et compréhension de leur inhibition par les beta-lactames

NMR study of bacterial L,D-transpeptidases : structure, dynamics and insights into their inhibition by beta-lacams

• Auteur / Autrice : Lauriane Lecoq
• Direction : Jean-Pierre Simorre, Bernhard Brutscher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 29/11/2012
• Etablissement(s) : Grenoble
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Institut de Biologie Structurale
• Jury : Président / Présidente : Winfried Weissenhorn
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Pierre Simorre, Michel Arthur, Catherine Bougault
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Ivo gomperts Boneca, Bruno Kieffer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sciences de la vie

Mots clés libres

Transpeptidase

Résistance aux antibiotiques

Peptidoglycane

Beta-lactame

Transpeptidase

Antibiotic resistance

Peptidoglycan

Beta-lactame

Résumé

L'étape finale de biosynthèse du peptidoglycane est catalysée par les D,D-transpeptidases (PBPs), l'une des cibles principales des antibiotiques de type beta-lactame. Récemment, il a été montré qu'une nouvelle classe d'enzymes, les L,D-transpeptidases (LDts), permet de contourner l'inhibition des PBPs. Ces LDts ont été identifiées tant dans des bactéries résistantes aux beta-lactames que dans des formes dormantes de Mycobacterium tuberculosis. Les seuls beta-lactames capables de les inhiber, les carbapénèmes, forment une liaison covalente avec la cystéine catalytique des LDts. Ni le mécanisme de cette inactivation, ni la spécificité de ces enzymes pour les carbapénèmes ne sont toutefois expliqués à ce jour. Le but du présent travail consiste en l'investigation par RMN du mécanisme d'acylation des LDts par ces antibiotiques. Dans ce contexte, la première partie de cette thèse s'intéresse à la compréhension actuelle de l'émergence de ce phénomène de résistance. La seconde partie traite des principes de la RMN et des implémentations développées pour étudier la structure, la thermodynamique et la dynamique des LDts. La troisième et dernière partie démontre le succès de l'approche RMN dans l'étude des diverses étapes de la réaction d'acylation, à travers une étude détaillée de l'apoenzyme, de complexes non covalents avec différents beta-lactames, et de l'enzyme acylée par un carbapénème. Au cours de cette étude, la structure du site actif de l'apoenzyme de Bacillus subtilis a été affinée par rapport à une étude cristallographique antérieure. Pour cette enzyme et son pendant chez Enterococcus faecium, nous avons démontré que la spécificité pour les carbapénèmes n'intervient pas au stade de la formation du complexe non covalent. Pour finir, la formation de la liaison covalente entre LDt et carbapénème induit un réarrangement conformationnel substantiel et une augmentation de la flexibilité de l'enzyme.

The final cross-linking step of the peptidoglycan synthesis is usually catalyzed by D,D-transpeptidases (PBPs), one of the main targets of beta-lactam antibiotics. Recently, it was shown that these PBPs can be by-passed by a novel class of enzymes, the L,D-transpeptidases (LDts), identified in beta-lactam-resistant bacteria as well as in dormant forms of Mycobacterium tuberculosis. The only beta-lactams enable to inactivate these enzymes belong to the carbapenem class. The beta-lactam ring of this antibiotic family then covalently binds the catalytic cysteine of the LDt. Neither the mechanism of this reaction nor the specificity for carbapenems are yet understood. The aim of the present work is to investigate the acylation mechanism of LDts with carbapenems by NMR. In this context, the first part of this thesis focuses on the current biological understanding of the emergence of this resistance pathway. The second part deals with the NMR principles and the implementations developed to study the structure, thermodynamics and dynamics of LDts. The third part demonstrates that NMR is successful in studying all the steps of the acylation reaction. For this purpose, the LDt apoenzyme, the non-covalent complex with various beta-lactams, and the LDt-carbapenem acylenzyme were thoroughly investigated. The structure of the active site of the Bacillus subtilis apoenzyme was refined with respect to a previous crystallographic study. For the latter and the Enterococcus faecium enzymes, we showed that the carbapenem specificity does not occur at the stage of the non-covalent binding. In contrast to non-covalent interactions, the formation of the covalent bond between LDts and carbapenems induces substantial conformational rearrangement and increased flexibility in the enzyme.