Ingénierie métabolique chez Enterococcus faecalis : intérêt biotechnologique et incidences sur la virulence : Thèse soutenue sur un ensemble de travaux

• Auteur / Autrice : Nosheen Rana
• Direction : Jean-Marie Laplace
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2012
• Etablissement(s) : Caen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pyruvate déshydrogénase

Stress

Lactate-déshydrogénases

Métabolisme

Bioéthanol

Entérocoques

Résumé

Enterococcus faecalis est une bactérie lactique qui fermente le lactose et qui a la propriété de se développer dans différentes conditions de stress. Chez E. Faecalis deux gènes de lactate déshydrogénase (ldh1 et ldh2) sont présents et le métabolisme conduit principalement à la production de lactate. Lorsque les deux gènes ldh sont interrompus, le rendement en éthanol est amélioré (Yp/s : 0,11 g/g) mais reste insuffisant dans l’optique du développement d’un procédé industriel. Les gènes pdc, codant pour l'enzyme pyruvate décarboxylase, de deux bactéries à Gram positif - Sarcina ventriculi (pdcSv) et Clostridium acetobutylicum (pdcCa) - ont été insérés chez le mutant Δldh2 d'E. Faecalis sous le contrôle du promoteur du gène ldh1. En utilisant le lactose comme substrat, des rendements en éthanol de 0,19 g/g avec pdcSv et 0,18 g/g avec pdcCa ont été obtenus. Le gène pdcCa a également été exprimé chez le double mutant ldh en utilisant un plasmide d’expression et un haut niveau d’expression et d’activité de l'enzyme PDC a permis d’obtenir un rendement en éthanol de 0,46 g/g. E. Faecalis génétiquement modifiée pourrait être utilisée pour la production d'éthanol à partir du lactosérum sous-produit de l'industrie laitière. Les analyses transcriptionnelles ont montré qu’en l'absence d'enzymes LDH, le pyruvate est redistribué vers différentes voies cataboliques en fonction de l'affinité des enzymes afin de maintenir l'équilibre d'oxydo-réduction. Les mutants ldh sont généralement moins résistants à différents stress et moins capables de colonisation tissulaire que la souche sauvage. Cela montre que l'enzyme LDH joue un rôle majeur dans la survie et la virulence d’E. Faecalis.

Enterococcus faecalis is a lactic acid bacterium that can metabolize lactose and has the ability to withstand many environmental stresses. E. Faecalis harbours two genes of lactate dehydrogenase (ldh1 and ldh2) and the metabolism leads mainly to the production of lactate. When both ldh genes were deleted the ethanol yield was increased (Yp/s : 0. 11g/g). The pyruvate decarboxylase genes (pdc) , from two Gram positive bacteria - Sarcina ventriculi (pdcSv) and Clostridium acetobutylicum (pdcCa) - were inserted under the control of the ldh1 promoter in the ∆ldh2 mutant strain. Using lactose as substrate, ethanol yield were 0. 19 g/g and 0. 18 g/g, with pdcSv and pdcCa respectively. The pdcCa was also expressed in the ldh double mutant using an expression plasmid carrying a promotor inducible with nisin leading to an ethanol yield of 0. 46 g/g. Therefore, genetically engineered E. Faecalis could be used for ethanol production from dairy wastes rich in lactose. Transcriptional analysis showed that in the absence of LDH enzymes, pyruvate is distributed through different metabolic pathways, depending on the affinity of the enzymes for pyruvate, in order to maintain the redox balance. Therefore, a differential expression of the genes involved in pyruvate metabolism was observed. In addition, the ldh mutants were found to be generally more sensitive to different stresses than the wild type strain and also less capable of colonizing cells host. This shows that the enzyme ldh has a main role in the survival of E. Faecalis under stressed conditions and that it is essential for virulence.