Génération et amélioration de protéines chimériques solubles associant un TCRγδ et la molécule pro-apoptotique FasL

Generation and improvement of soluble chimeric proteins associating a γδTCR and the pro-apoptotic FasL molecule

• Auteur / Autrice : Aurore Morello
• Direction : Jean-Luc Taupin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences, technologie, santé. Biologie cellulaire et physiopathologie
• Date : Soutenance le 05/12/2012
• Etablissement(s) : Bordeaux 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Javerzat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Veronique Castro-Quemener
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Odile Jauberteau-Marchan, Bruno Ségui

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cancer -- Thérapeutique

Apoptose

Mots clés libres

Apoptose

FasL

Cancer

Protéines de fusion

Apoptosis

FasL

Cancer

Fusion proteins

Résumé

Le Fas Ligand (FasL) est le déclencheur naturel de l’apoptose induite par le récepteur Fas. Il est produit sous la forme d’une protéine membranaire homotrimérique, qui peut être clivée par une métalloprotéase pour engendrer une forme soluble (sFasL). Cette forme conserve sa structure homotrimérique, mais son activité pro-apoptotique est très faible car elle n’atteint pas un degré de polymérisation suffisant. Au laboratoire, une molécule sFasL hautement polymérique a été obtenue en fusionnant un domaine de type immunoglobuline au domaine extracellulaire du FasL. Ce domaine permet de polymériser le sFasL sous forme hexamérique et dodécamérique. Cette molécule appelée pFasL possède une activité anti-tumorale in vitro et in vivo dans un modèle de greffe de cellules humaines tumorales à des souris immunodéficientes. Dans cette étude, nous nous sommes focalisés sur l'amélioration de pFasL, avec deux objectifs complémentaires. Tout d'abord, nous avons fusionné un récepteur à l’antigène de lymphocytes Tγδ (TCRγδ) au pFasL (TCR-pFasL) de façon à orienter son activité vers les cellules tumorales carcinomateuses exprimant l’antigène spécifique de ce TCR, qui est l’EPCR (Endothelial Protein C Receptor). Ensuite, nous souhaitions améliorer la production et l’activité spécifique de pFasL et son dérivé TCR-pFasL. La stratégie de ciblage dépendante du TCR n’a pas été validée dans cette étude, mais nous avons pu décrire une approche originale pour améliorer la production et/ou l’activité cytotoxique de ces chimères en co-exprimant celles-ci avec du sFasL non apoptotique. Cette approche a été validée avec deux autres chimères obtenues à partir de pFasL, l’une contenant la molécule de présentation antigénique HLA-A2 et la seconde le ligand CD80 du récepteur CD28, pour lequel le ciblage fonctionne. Notre étude ouvre ainsi des perspectives pour appliquer ce protocole à une grande variété de protéines de fusion dérivées du sFasL pour des applications diverses, en recherche et en thérapie.

Fas ligand (FasL) is the natural trigger for apoptosis induced by the Fas receptor. FasL exists as an homotrimer on the cell surface, which can be cleaved by a metalloprotease to generate a soluble form (sFasL). The sFasL form retains its homotrimeric structure, but displays almost no pro-apoptotic activity because it does not reach a sufficient degree of polymerisation. In the laboratory, a highly polymeric molecule sFasL was obtained by fusing an immunoglobulin-like domain to the extracellular domain of FasL. This domain polymerises the molecule through disulphide bonds, leading to hexameric and dodecameric compounds. This molecule, called pFasL, possesses an anti-tumor activity in vitro but also in vivo in a model of human tumor cell transplanted to immunodeficient mice. In this study, we focused on improving pFasL with two complementary objectives. Firstly, we fused to pFasL an antigen receptor of γδ T-cells (TCRγδ, leading to TCR-pFasL) to direct its activity towards carcinoma cells expressing this TCR specific antigen, which is the EPCR (Endothelial Protein C Receptor). Then, we wanted to improve the production and specific activity of pFasL and its derivative TCR-pFasL. In this study, the TCR dependent targeting strategy has not been validated, but we have described a novel approach to improve the production and/or cytotoxic activity of these chimeras by coexpressing them with non-apoptotic sFasL. This strategy has been validated with two other chimeras obtained from pFasL, one containing the antigen-presenting molecule HLA-A2 and the second one CD80, the ligand for the CD28 receptor. For this latter one, the cell targeting activity proved efficient. Our study opens up opportunities to improve and develop a wide variety of sFasL-derived fusion proteins for various applications in research and therapy.