Spectroscopie de corrélation de fluorescence : fluidité membranaire et détection de molécule unique en solution concentrée

Fluorescence correlation spectroscopy : membrane fluidity and single molecule detection in concentrated solution

• Auteur / Autrice : Pascale Winckler
• Direction : Rodolphe Jaffiol
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Optique et nanotechnologies
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Troyes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'Ingénieur (Troyes, Aube)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Membrane cellulaire

Spectroscopie de fluorescence

Photonique

Microscopie

Biophysique

Résumé

La Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) est une technique de molécules uniques particulièrement bien adaptée aux études en milieu biologique. Elle est ici mise en œuvre pour analyser localement la membrane plasmique de cellules vivantes. Dans un premier temps, la distribution de la microfluidité membranaire de cellules vivantes a été caractérisée grâce à des mesures de temps de diffusion par FCS. Nous avons ainsi pu établir la loi de distribution de la fluidité membranaire à l’échelle de la cellule unique pour différentes lignées cellulaires (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA et MDCKII). Une simulation Monte-Carlo montre qu’un modèle simple de diffusion à deux dimensions dans une matrice contenant des microdomaines visqueux peut rendre compte de l’allure asymétrique typique des distributions obtenues. Ce résultat a été utilisé pour évaluer les modifications membranaires liées à la surexpression de la P-glycoprotéine, protéine responsable d'un phénomène de résistance à la chimiothérapie. Nous avons également comparé la structuration membranaire de diverses lignées cancéreuses, chacune se déclinant en une version sensible et une version résistante à un médicament : la Doxorubicine. Dans un second temps, nous proposons une nouvelle méthode d’illumination locale basée sur un transfert d’énergie non radiatif. Cette méthode permet de réduire la profondeur de champ du microscope à l’échelle nanométrique. Nous en démontrons ici le potentiel pour l'utilisation de la FCS dans des solutions micromolaires ainsi que pour l'imagerie de l'adhésion cellulaire

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a single molecule technique very well suited for in vivo studies. We have used FCS to explore plasma membrane microfluidity of living cells. Measurements were conducted at the single cell level, which enabled us to get a detailed over-view of the typical plasma membrane microviscosity distribution of each cell line studied (LR73, MCF7, KB3. 1, MESSA and MDCKII). A Monte Carlo simulation based on a 2D diffusion model enables us to link the asymetric fluidity distribution profile with the plasma membrane micro-organization. This result was used to determine the membrane organisation related to the surexpression of the P-glycoprotein (Pgp), a protein implicated in multidrug resistance. We also compare the membrane structuration of various cancer cell lines, each comes in two versions, a sensitive one and a resistant one to a chemotherapeutic drug: the Doxorubicin. Secondly, we propose a new excitation scheme based on a nonradiative energy transfert. This approach allow us to reduce the illumination depth of the microscope at the nanometric scale. We demonstrate its potential through two applications: FCS in micromolar solutions and fluorescence imaging on cells adhesion areas