Optimisation de la biosécurité du vecteur transposon piggyBac pour le transfert de gène : utilisation des ARN messagers et des insulateurs.

Optimization of the biosafety of the piggyBac transposon for gene transfer using mRNA and insulators

• Auteur / Autrice : Solenne Bire
• Direction : Florence Rouleux-Bonnin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance le 09/12/2011
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Santé, sciences, technologies (Tours)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Génétique, Immunothérapie, Chimie et Cancer (Tours)
• Jury : Président / Présidente : Chantal Pichon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Guivarc'h, Yves Bigot, Nicolas Mermod
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marinee Chuah, Patrick Erbacher

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vecteurs de clonage

ARN messagers

Transposons

Transfert génétique

Mots clés libres

Transposon PiggyBac

Gene transfer

Biosafety

Transposon

PiggyBac

MRNA

Insulators

Résumé

Les progrès en biotechno]ogie ont permis le développement d’outils pour le transfert de gène intégratif en transgénèse, bioproduction et thérapie génique. Cependant, trois challenges majeurs doivent être relevés pour garantir un système sécurisé : l’innocuité et l’efficacité du transfert, l’intégration ciblée et contrôlée dans le génome, le niveau et la durée d’expression du transgène au cours du temps. Dans ce but, mes travaux de thèse ont consisté à tester des solutions pour améliorer la biosécurité du transposon piggyBac qui nécessite un plasmide porteur du gène d’intérêt à insérer dans le génome et une source de transposase catalysant la réaction d’intégration du transgène. Une des stratégies de ma thèse repose sur l’apport de la source de transposase sous forme d’ARN messager au lieu d’ADN afin d’améliorer la stabilité de l’intégration et de réduire les effets génotoxiques en limitant la transposase dans les cellules. Pour la première fois, la biodisponibilité de l’ARNm de la transposase et les conditions optimales d’utilisation en cellules humaines ont été déterminées pour augmenter la biosêcurité du système. Le second objectif de mes travaux consiste à améliorer l’expression du transgène en ajoutant des insulateurs connus pour s’opposer à l’extinction de l’expression des gênes. En termes de biosécurité, cette stratégie permet de réduire le nombre de copies du transgène nécessaires pour obtenir une expression suffisante. Deux candidats ont été identifiés pour améliorer l’expression du transgène. La combinaison des approches ARNrn et insulateurs est prometteuse pour sécuriser le transfert de gène médié par piggyBac et pour maintenir l’expression du gène d’intérêt.

Advances in biotechnology have enabled the development of tools for gene transfer applicable to transgenesis, bioproduction and gene therapy. But, 3 major challenges must be met to ensure a secure system: the safety and effectiveness of the transfer. the targeted and controlled integration into the genome. and the level of transgene expression over time. In this aim, my thesis project was to validate solutions to improve the biosafety of the piggyBac transposon, which requires a plasmid carrying the gene of interest to be inserted in the genome, and a source of transposase which catalyzes the transgene integration. One approach of my thesis work is to deliver the source of piggyBac transposase as an mRNA molecule instead of DNA. This strategy aims to improve the stability of the integration and reduce the genotoxic effects by limiting the transposase in the cells. For the 1st time, the bioavailability of the transposase rnRNA and the optimal conditions for its use in human cells were determined to increase the biosafety of the transposon system. The 2nd objective ofmy project is to improve the expression of the transgene by adding insulators known to counteract the transgene silencing. This strategy reduces the number of integrations required ta get a sufficient expression of the transgene and thus, improve biosecurity. Two candidates have been identified to improve transgene expression. The combination of the mRNA and insulator strategies is promising to secure the piggyBac-mediated gene transfer and to maintain the expression of the gene of interest