Caractérisation fonctionnelle et ciblage pharmacologique de tyrosine kinases dans les leucémies aiguës myéloïdes : entre signalisation et épigénétique

Tyrosine kinases characterization and pharmacological targeting in acute myeloid leukemia : from signalization to epigenetic process

• Auteur / Autrice : Camille Fialin
• Direction : Christian Récher, Serge Roche
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Cancérologie
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules cancéreuses

Hématopoïèse

Épigénétique

Tyrosine kinases

Leucémie aigüe myéloïde

Mots clés libres

Récepteurs à activité tyrosine kinase

Ron

Tyrosine kinases

Lyn

Leucémies Aiguës Myéloïdes

Epigénétique

Thérapies ciblées

Inhibiteurs de TK

Protéomique

Silac

Résumé

Les Tyrosine Kinases (TK) sont à des carrefours clés de la signalisation intracellulaire régulant des processus cellulaires essentiels comme la survie, la migration et la différenciation cellulaire. Une telle position centrale en physiologie explique que leur dérégulation s'accompagne d'un potentiel oncogénique important. Les Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) sont un groupe hétérogène de pathologies hématopoïétiques caractérisées par une prolifération excessive des progéniteurs leucémiques et par un blocage de différenciation des cellules leucémiques. L'acquisition du phénotype leucémique requiert donc, d'une part, des mutations affectant des facteurs de transcription régulant des gènes de la différenciation myéloïde et, d’autre part, des dérégulations de molécules de la signalisation conférant à la cellule leucémique un avantage prolifératif. Dans ce contexte, les TK sont des acteurs essentiels du maintien du phénotype leucémique et de la médiation du signal oncogénique. L'objectif de ce travail de thèse a été de caractériser une nouvelle voie de signalisation initiée par une forme courte du récepteur Ron et la TK cytoplasmique Lyn, d'établir des interconnections fonctionnelles, de comprendre leur régulation et d'envisager un potentiel impact thérapeutique ciblé sur les TK dans les cellules de LAM. Mes travaux portent sur l'étude du récepteur à activité tyrosine kinase Ron (Récepteur d’Origine Nantais), appartenant à la famille du récepteur c-Met, dans les LAM. J'ai ainsi montré l'expression d'une forme courte de ce récepteur sf-Ron (short-form Ron) dans certains échantillons de patients atteints de LAM mais pas dans les cellules normales hématopoïétiques de donneurs sains suggérant un mécanisme oncogénique sous-jacent. Cette forme courte est dépourvue du domaine extracellulaire de liaison au ligand mais garde le domaine intracellulaire portant l'activité tyrosine kinase conduisant à son activation constitutive. Un décryptage de sa signalisation a révélé une interaction fonctionnelle, privilégiée de sf-Ron avec la Src Kinase Lyn, s'activant l'une l'autre. Ce module sf-Ron/Lyn agit en amont du complexe protéique mTORC1 afin de promouvoir la survie et la prolifération des cellules leucémiques. Un ciblage pharmacologique en utilisant des inhibiteurs de c-Met, présente une activité anti-leucémique spécifiquement dans les cellules de patient sf-Ron positives ainsi que dans leur compartiment immature, dit « souche », chimiorésistant, responsable des rechutes fréquentes observées en clinique. L'utilisation de modèles animaux xénogreffés avec des cellules de LAM a témoigné d'une inhibition de la prise de greffe des cellules traitées avec ses inhibiteurs. De plus, l'analyse de sa régulation a révélé un mécanisme épigénétique complexe suggérant de potentiels nouveaux mécanismes de résistance développés par certains patients face aux agents hypométhylants. Un deuxième aspect de mon étude porte sur l'étude de la Src kinase : Lyn. Notre équipe a montré que cette TK était fortement dérégulée dans les cellules de LAM. Mais rien n'était connu sur ses mécanismes de dérégulation. Par une approche de phosphoprotéomique quantitative de type SILAC, je me suis efforcée, par la caractérisation de plusieurs substrats potentiels, à fournir de premières pistes d'études permettant d'expliquer une telle dérégulation. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis la caractérisation de sf-Ron impliquée dans la biologie tumorale des LAM et conférant aux cellules une sensibilité aux inhibiteurs de c-Met. De façon générale, une meilleure compréhension des interactions fonctionnelles impliquant des TK, véritables nœuds de la signalisation, contribue à une appréhension globale de la pathologie et aux développements de thérapies ciblées permettant une prise en charge thérapeutique personnalisée des patients.

Tyrosine Kinases (TK) are important mediators of the signaling cascade, determining key roles in diverse biological processes like growth, differentiation, metabolism and apoptosis in response to external and internal stimuli. Though their activity is tightly regulated in normal cells, they may acquire transforming functions due to mutation, overexpression and autocrine paracrine stimulation, leading to malignancy and cancer. Acute myeloid leukemia (AML) are heterogenous group of hematopoietic disorders characterized by an accumulation of immature leukemic cells and by a block of differenciation. Despite much research on the pathology of AML, clear understanding is clouded by the heterogeneity and complexity of the disease. In most cases, the leukemia appears to be driven either by several key mutations or by overexpressed enzymes, especially tyrosine kinases. My thesis work was devoted to decipher the oncogenic signaling initiated by two TK: the short form of the receptor Ron and the cytoplasmic TK Lyn. By establishing functional links and understanding their regulation, our purposes are to envisage a potential therapeutic strategy targeting TK in AML cells. Here, we have assessed the expression of the Recepteur d’Origine Nantais (RON) in both leukemic cell lines and samples from AML patients. This receptor belongs to c-Met TK family. Both the full length (fl) and/or the short form (sf) of RON are expressed in some AML patient samples. Interestingly, sf-RON is not expressed in normal CD34+ hematopoietic cells and appears to bear most of the oncogenic signaling through interaction with the Src kinase Lyn. Sf-RON-mediated signaling in leukemic cells also involves mTORC1, but not the PI3-Kinase/Akt pathway. CMET/RON inhibitors exhibited an anti-leukemic activity exclusively in AML samples and cell lines expressing sfRON. Moreover the critical cell compartment enriched in leukemic stem cells responsible for clinical relapse, is sensitive to this treatment. Mice studies have confirmed anti-leukemic activities of Ron inhibition by impairing bone marrow engrafting. These results support clinical trials evaluating cMET/RON inhibitors in AML patients expressing sfRON. Furthermore, a complex epigenetic regulation was shown. The expression of sfRON was specifically down regulated by azacytidine. Conversely, azacytidine could induce the expression of sfRON in sfRON-negative leukemic cells suggesting that the activity of hypomethylating agents AML could involve modulation of oncogenic tyrosine kinases. Secondly, by using SILAC quantitative proteomics, I have identified potential Lyn substrates in AML. Lyn is critically deregulated in AML but nothing was known about these mechanisms. This preliminary part constitutes a first step in the understanding of Lyn deregulation in AML and brings additional knowledge of the AML kinome. To conclude, my thesis works suggest sf-Ron as therapeutic target in AML. Indeed, sf-Ron is involved in leukemogenic process and confers sensitivity to c-Met inhibitors in AML cells. A better understanding of the complexity of functional interactions involving TK is essential for global appreciation of the pathology and is a mean to gear up the tyrosine kinase drug discovery process.