Relations structure-fonction de la dynamine mitochondriale Msp1 : étude de ses relations avec la membrane interne et de ses activités biochimiques

Structure/functions relationship of the mitochondrial dynamin Msp1 : studies of its relations with the inner membrane and of its biochemical properties

• Auteur / Autrice : Alan Diot
• Direction : Laurent Emorine
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dynamines

Microdomaines membranaires

Mitochondries

Mots clés libres

Mitochondries

Membranes

Microdomaines

Hémifusion

GTPase

Résumé

La dynamique mitochondriale est définie comme un équilibre entre des forces antagonistes de fusion et de fission des membranes qui modulent la morphologie des mitochondries et jouent un rôle majeur dans la régulation des fonctions de l'organelle. Notre équipe a identifié l'un des acteurs de cette dynamique, une GTPase de la famille des dynamines appelée Msp1 chez la levure S. Pombe et OPA1 chez l'homme. Le dysfonctionnement d'OPA1 est responsable de l'atrophie optique dominante de type 1. Cette dynamine agit sur la fusion des mitochondries, la structure des crêtes et le maintien de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Elle module aussi la respiration et la synthèse d'ATP, avec des conséquences sur la viabilité cellulaire et sur l'apoptose chez les eucaryotes supérieurs. Au vue de cette pléiotropie, notre hypothèse est que la dynamine OPA1/Msp1 intervient dans l'organisation de la membrane interne des mitochondries. Mon travail de thèse a été initié pour définir les activités biochimiques de Msp1 à l'origine de ses effets biologiques, et les bases structurales sous-jacentes. Le rôle de deux domaines hydrophobes (TM1 et TM2) dans l'association aux membranes et les fonctions de Msp1 a été analysé in vivo dans la levure S. Pombe. Les propriétés biochimiques de Msp1 dans l'organisation des membranes ont été étudiées in vitro après purification et reconstitution dans des liposomes de composition phospholipidique similaire à celle de la membrane interne. Nos études in vivo ont montré que TM1 et TM2, et un troisième site d'interaction membranaire (SIM3), ont des rôles distincts dans l'association de Msp1 aux membranes, et dans la fusion des mitochondries et le maintien de l'ADNmt. Nous suggérons que l'organisation locale de la membrane interne est modulée par les proportions relatives des sites (TM1 + TM2) / SIM3, reflet du rapport entre une forme longue, l-Msp1, et une forme courte, s-Msp1, qui co-existent naturellement chez la levure et diffèrent par la présence de TM1 et TM2 dans l-Msp1 uniquement, SIM3 étant commun aux deux isoformes. Dans notre système in vitro, l'association de l-Msp1 et s-Msp1 aux liposomes et leur topologie reproduisent la situation observée dans les mitochondries. Nous avons montré que s-Msp1 a une activité GTPase caractéristique des dynamines avec une faible affinité apparente pour le GTP et une forte activité catalytique et qu'un motif coiled-coil C-terminal est nécessaire au développement de cette activité. Grâce à ce système, nous mettons en évidence pour la première fois que Msp1 favorise l'hémifusion des liposomes et a donc un rôle direct dans la fusion membranaire. L'hémifusion est induite par les deux isoformes l Msp1 et s-Msp1 et est indépendante de l'activité GTPase et de l'oligomérisation de la dynamine. SIM3, qui est commun à l-Msp1 et s-Msp1, pourrait donc contenir les éléments structuraux requis pour l'hémifusion. L'ensemble de ce travail nous permet de proposer un modèle dans lequel Msp1 agirait comme organisateur de la membrane et comme commutateur moléculaire. A chacun de ses sites d'action, la dynamine entrerait dans des complexes multi-protéiques distincts dont la composition dépendrait des proportions relatives de chacune des isoformes, donc du rapport (TM1+TM2) / SIM3. La modification de ce rapport par l'hydrolyse du GTP modulerait l'organisation locale de la membrane et donc la composition et l'activité de ces complexes.

Mitochondrial dynamics is defined as an equilibrium between antagonistic fusion and fission forces that control mitochondrial morphology and play a major role in the regulation of mitochondrial functions. Our group identified one actor of mitochondrial dynamics, a GTPase of the dynamins' family called Msp1 in the S. Pombe yeast and OPA1 in humans. OPA1 dysfunction leads to type 1 dominant optic atrophy. This dynamin acts in mitochondrial fusion and is involved in the maintenance of cristae structure and of mitochondrial DNA (mtDNA). It also controls respiration and ATP synthesis with impacts on cellular viability and apoptosis in higher eukaryotes. Given this large spectrum of action, our hypothesis is that Msp1/OPA1 acts on the organization of the mitochondrial inner membrane. My PhD thesis was initiated to define the biochemical activities of Msp1 responsible for its biological effects, and the underlying structural basis. The role of two hydrophobic domains (TM1 and TM2) in Msp1 membrane association and functions was analysed in vivo in S. Pombe cells. The biochemical properties of Msp1 in membranes organization were studied in vitro after purification and reconstitution into liposomes of phospholipd composition similar to that of the mitochondrial inner membrane. Our in vivo studies showed that TM1 and TM2, and a third site of membrane interaction (SIM3), play distinct roles in Msp1 membrane association and in mitochondrial fusion and mtDNA maintenance. We suggest that the local organisation of the inner membrane varies with the relative proportions of the domains (TM1+TM2)/SIM3 reflecting the ratio between a long, l-Msp1, and a short, s-Msp1, isoform that naturally occur in S. Pombe and differ by the presence of TM1 and TM2 in l-Msp1 only, SIM 3 being common to both. In our in vitro system, the association and topology of l-Msp1 and s-Msp1 onto liposomes are similar to that observed in mitochondria. We showed that s-Msp1 has a GTPase activity similar to that of dynamins, with a low affinity for GTP and a high catalytic activity, and that a C-terminal coiled-coil motif is essential for this activity. With this system we show for the first time that Msp1 induces hemifusion of liposomes, indicating a direct role in membrane fusion. Hemifusion was induced by both l-Msp1 and s-Msp1 isoforms and was independent from GTPase activity and from self-assembly. SIM3, which is common to l-Msp1 and s-Msp1, may thus contain the structural requirements for hemifusion. Altogether, this work allows us to propose a model in which Msp1 could act as a membrane organizer and as a molecular switch. At each of its sites of action, the dynamin could enter in distinct multi-protein complexes, the composition of which could depend on the relative proportions of each Msp1 isoforms, i. E. Of the (TM1+TM2)/SIM3 ratio. Modification of this ratio by GTP hydrolysis would modulate local membrane organisation, and hence the composition and activity of these complexes.