Détection universelle et rapide de micro-organismes par fluorescence : fondamentaux, stratégies et applications

Universal and rapid detection of micro-organisms by fluorescence : basics, strategies and applications

• Auteur / Autrice : Anne Jung-Baumstummler
• Direction : Claude Kedinger, Etienne Weiss
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du vivant
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytométrie de flux

Marqueurs biologiques

Biotechnologie

Microbiologie pharmaceutique

Résumé

Les contrôles microbiologiques en industrie pharmaceutique reposent sur l’utilisation de techniques de microbiologie traditionnelle. Bien que simples et fiables, ces méthodes ne délivrent des résultats qu’au terme d’un temps d’attente très long. L’objectif de cette thèse était d’élaborer deux nouvelles méthodes simples, l’une quantitative, l’autre qualitative, permettant une détection rapide, non-destructive et universelle de contaminants microbiens viables. Les premiers travaux ont abouti à la mise au point d’une méthode de détection quantitative répondant aux critères fixés initialement. Elle consiste à mettre en évidence la présence de microcolonies, non visibles à l’œil nu, à la surface d’une membrane filtrante, en utilisant une solution de marquage. Cette solution est composée d’un marqueur de viabilité fluorogénique et d’un tampon de perméabilisation permettant la pénétration de ce dernier à l’intérieur des germes, sans affecter la viabilité cellulaire. Cette nouvelle méthode permet de détecter les micro-organismes deux à cinq fois plus rapidement que la méthode de microbiologie traditionnelle. La deuxième partie de cette thèse a été consacrée à l’élaboration d’une méthode de détection universelle qualitative par cytométrie en flux. Ces travaux ont abouti à la sélection du marqueur de viabilité optimal et ont montré l’importance de perméabiliser les germes. Des limitations liées à une variation du signal de fluorescence dans le temps ont également été mises en évidence. Cette étude constitue les premières étapes de la mise au point de la méthode et offre des perspectives intéressantes quant à sa potentielle utilisation.

Microbiological controls in the pharmaceutical industry are based on the use of traditional microbiology methods. Although simple and reliable, these methods deliver results only after a long incubation time. The objective of this thesis was to develop two new simple methods, one quantitative, one qualitative, allowing a rapid, nondestructive and universal detection of viable microbial contaminants. The first studies led to the development of a quantitative detection method that satisfies the initial criteria. The principle is to detect the presence of microcolonies, not visible to the naked eye, on the surface of a membrane filter, using a staining solution. This solution is composed of a fluorogenic viability marker and a permeabilization buffer allowing the penetration of the latter within the micro-organisms, without affecting their viability. This new method can detect micro-organisms two to five times faster than traditional microbiology methods. The second part of this thesis was devoted to the development of a universal and qualitative detection method using flow cytometry. This work led to the selection of the optimal viability marker and showed the importance of permeabilizing micro-organisms. Limitations due to a variation of the fluorescence signal over time were also highlighted. This study represents the first stages of the method development and offers interesting perspectives as to its potential use.