Évolution dirigée et biopile enzymatique : étude de la laccase CotA et optimisation par évolution dirigée en microfluidique digitale

Directed evolution and enzymatic biofuel cells : study of CotA laccase and its optimization by directed evolution using droplet based microfluidic

• Auteur / Autrice : Thomas Beneyton
• Direction : Valérie Taly
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences chimiques
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microfluidique

Piles à combustible

Glucose oxidase

Laccase

Sources d'énergie bioélectrique

Mots clés libres

Laccase CotA

Résumé

Les biopiles enzymatiques ont vu le jour pour développer des sources miniatures d’électricité renouvelable. Cette technologie naissante est cependant encore limitée en termes de puissance ou de durée de vie. Bien qu’encore peu employée, une stratégie pour améliorer ces performances consiste à optimiser les propriétés catalytiques ou de stabilité des enzymes. Ces travaux de doctorat décrivent le développement d’une plateforme de microfluidique digitale permettant l’évolution dirigée de la laccase CotA de Bacillus subtilis pour une utilisation dans une biopile enzymatique. Ces travaux démontrent la possibilité d’utiliser une enzyme extrêmophile au sein d’une biopile enzymatique. L’efficacité de CotA en tant que biocatalyseur de la réduction de l’O2 a été évaluée pour la première fois en développant des biocathodes ou des biopiles Glucose/O2 complètes. Une plateforme microfluidique modèle de criblage à très haut débit applicable à l’évolution dirigée de la laccase CotA a également été mise au point et validée. La plateforme permet l’encapsulation de cellules E. Coli exprimant la protéine dans des microgouttelettes aqueuses de quelques picolitres, l’incubation des microgouttelettes, l’ajout du substrat par picoinjection puis la détection et le tri de l’activité enzymatique de CotA à très haut débit (1 million de clones en seulement 4 heures). La plateforme est directement applicable au criblage de banques de mutants et les variants optimisés sélectionnés devraient mener à la création d’une nouvelle génération de biopiles plus efficaces. Cette plateforme universelle de criblage constitue un outil à la fois versatile et puissant pour l’évolution dirigée des protéines.

Enzymatic biofuel cells have been recently developed to create miniature renewable electricity sources. However, this new technology is still limited in terms of power and lifetime compared to classical fuel cells. Although it has been rarely used yet, one strategy to improve these performances is to optimize the catalytic and stability properties of the enzymes. This PhD work describes the development of a droplet-based microfluidic platform for thr directed evolution of CotA laccase from Bacillus subtilis for enzymatic biofuel cells application. This work demonstrates the possibility of using an extremophilic enzyme inside an enzymatique biofuel cell. The efficiency of CotA as a biocatalyst for O2 reduction has been evaluated for the first time developing biocathodes or complete Glucose/O2 biofuel cells. A droplet-based microfluidic high-throughput screening platform for CotA directed evolution has also been developed and validated. This platform allows the encapsulation of E. Coli cells expressing the protein in aqueous droplets of few picoliters, the incubation of droplets, the addition of the substrate using picoinjection and then the detection and the sorting of CotA enzymatic activity using very high-throughput (1 million clones in only 4 hours). The platform can be directly used for the screening of mutant libraries. Optimized selected mutants would lead to the creation of a new and more efficient generation of enzymatic biofuel cells. This universal droplet-based microfluidic screening platform is a very powerful tool for directed evolution of proteins.