Contribution à la détermination de la structure de la sous-unité RPB11 de l’ARN polymérase II humaine

Contribution to the determination of the structure of subunit RPBII of human RNA polymerase II

• Auteur / Autrice : Kambiz Naderi
• Direction : Marc Vigneron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Strasbourg

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plasmodium falciparum

Transcription génétique

Structure

ARN polymérases

Résumé

L’ARN polymérase II (ARNP II) transcrit la quasi-totalité du génome nucléaire eucaryotique. L’ARNP II est un complexe constitué de 12 sous-unités. Une étape importante de son assemblage est la formation d’un hétérodimère entre les sous-unités RPB3 et RPB11. Nous avons examiné les interactions par double hybride entre les sous-unités RPB3 et RPB11, soit humaines, soit de levure, ainsi que l’effet de diverses mutations sur les interactions observées. Nous avons démontré que la protéine RPB11 humaine codée par le gène POLR2J1 forme un dimère stable, au contraire de son homologue de levure qui en est incapable. Nous avons constaté que les interactions observées ne sont pas sensibles aux mêmes mutations en particulier celles qui affectent un motif spécialement conservé nommé «motif alpha» que l’on retrouve jusque dans la sous-unité alpha de l’ARNP eubactérienne. Nous avons réussi à cristalliser cette protéine afin de contribuer à la détermination de la structure tridimensionnelle de l’ARNP II humaine. Nous avons caractérisé génétiquement l’ARNP II de Plasmodium falciparum en réalisant des tests de complémentation fonctionnelle des sous-unités de ce complexe enzymatique. Nos résultats indiquent que les sous-unités PfRPB4-5-7-9 et 12 codent des protéines capables de remplacer leurs homologues chez la levure Saccharomyces cerevisiae. De fait, nous avons construit des lignées de levures exprimant de façon stable des protéines de P. Falciparum. Par ailleurs, les sous-unités PfRPB3-6-8-10 et 11 ne complémentent pas. Nous avons aussi construit des souches viables de levures dont le site de fixation de l’alpha-amanitine sur leur ARNP II est «plasmodifié» ou «humanisé».

The RNA polymerase II (RNAPII) enzyme transcribes nearly of the whole eukaryotic nuclear genome. Controling its activity as well as its coupling with other nuclear processes such as DNA reparation is especially critical to avoid tumorogenesis and cancer. RNAPII consists in complex of 12 subunits. Though its assembly process is still poorly characterized, the formation of an heterodimer between, RPB3 and RPB11 subunits seems to be a critical step. We have analyzed the interactions between the RBP3 and RPB11 subunits, either human or yeast, and the effect of various mutations of RPB11 on these interactions. We demonstrate that the POLR2J1 encoded human RPB11 isoform is able to dimerize in contrast to its yeast counterpart. Mutations affecting an peptidic motif known as the “α-motif”, that is found up to the alpha subunit of eubacterial RNA polymerase, affect RPB11 homodimeric and RPB3/RPB11 heterodimeric interactions differentally. In an effort to contribute to the resolution of the three-dimensional structure of the human RNAPII, we were able to cristallize this human RPB11 subunit. We performed a genetic characterization of the RNAPII of Plasmodium falciparum. After reconstitution and cloning 10 putative RNAPII subunits, we performed yeast genetic complementation assays. We demonstrated that five subunits were indeed functional in a yeast heterologous system (RPB4, 5, 7, 9 and 12), and five not (RPB3, 6, 8, 10 and 11). In addition, we engineered yeast cell lines whose RNAPII was modified so as to mimick either the human or the Plasmodium falciparum active sites.