Recrutement des sous-unités p47phox et Rac lors de l’activation de la NADPH oxydase dans les phagocytes
Auteur / Autrice : | Marie-Cécile Faure |
Direction : | Oliver Nüsse, Eric Tschirhart |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Biologie cellulaire et moléculaire |
Date : | Soutenance le 09/09/2011 |
Etablissement(s) : | Paris 11 en cotutelle avec Université du Luxembourg |
Ecole(s) doctorale(s) : | École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2000-2015) |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : Laboratoire de Biologie et Physiologie Intégrée ( LBPI), CNRS / GDRE - ITI, Université du Luxembourg - Signalisation Cellulaire et Calcium, INSERM : U757. |
Jury : | Président / Présidente : Marc Le Maire |
Examinateurs / Examinatrices : Jean-Pol Frippiat | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Hélène Paclet, Florence Niedergang |
Mots clés
Résumé
Lors d’une infection, les polynucléaires neutrophiles phagocytent l’agent pathogène et le détruisent grâce à la production de formes réactives de l’oxygène (FRO) par la NADPH oxydase. Cette enzyme est constituée de sous-unités membranaires (Nox2, p22phox) et cytosoliques (p67phox, p47phox,p40phox, Rac) qui s’assemblent soit à la membrane plasmique, lors de l’activation des cellules par un stimulus soluble comme le fMLF, soit à la membrane du phagosome, lors de la phagocytose de particules. La régulation de la NADPH oxydase implique divers facteurs comme la signalisation calcique et les lipides, notamment les phospholipides anioniques. En effet, il a été montré que l’activation et la translocation de la petite protéine G Rac peuvent être dépendantes du calcium. D’autre part les sous unités Rac et p47phox peuvent interagir avec les phospholipides anioniques tels que la phosphatidylsérine,grâce à des interactions stéréosélectives et/ou électrostatiques.L’objectif de ce travail est donc d’évaluer le rôle du calcium et de la phosphatidylsérine dans le recrutement de p47phox et/ou Rac lors de l’assemblage de NADPH oxydase. Pour suivre la dynamique des deux protéines, nous avons exprimé ces sous-unités marquées avec des protéines fluorescentes dans des lignées phagocytaires mimant les neutrophiles (HL-60 et PLB-985). Nous avons ainsi pu suivre, par vidéomicroscopie, le déplacement des sous-unités marquées lors d’une stimulation par fMLF ou PMA etdurant la phagocytose de particules opsonisées. Après stimulation par fMLF, Rac1 transloque du cytosol à la membrane plasmique, alors que le mutant constitutivement actif de Rac1 est constamment localisé àla membrane plasmique, indépendamment de la stimulation par fMLF. De plus après stimulation parPMA, le mutant constitutivement actif de Rac2 transloque à la membrane plasmique, suggérant que sa translocation pourrait être possible en absence d’un influx de calcium extracellulaire. Lors de la phagocytose, en masquant la phosphatidylsérine avec le domaine C2 discoïdine de la lactadhérine qui lie spécifiquement ce phospholipide, nous avons pu montrer que la phosphatidylsérine régule la production initiale des FRO en favorisant le recrutement de p47phox et de Rac2 au phagosome. De plus, ces deux sous-unités se détachent du phagosome alors que la production intraphagosomale de FRO continue,suggérant que leur départ n’est pas un signal de terminaison pour l’activité oxydase. Plus précisément,p47phox et Rac2 sont recrutées de manière transitoire, pendant seulement 1 à 3 minutes après la fermeture du phagosome. Ceci est en accord avec le modèle qui propose que p47phox servirait principalement à transporter p67phox au phagosome, et que les deux sous-unités p47phox et Rac2 faciliteraient le positionnement de p67phox dans le complexe membranaire.