Ciblage d’acides nucléiques G-quadruplexes : synthèse et développement de méthodes pour l’analyse et le criblage de ligands sélectifs multimodaux

par Eric Largy

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Marie-Paule Teulade-Fichou.

Soutenue le 30-11-2011

à Paris 11 , dans le cadre de Ecole doctorale Chimie de Paris-Sud (Orsay, Essonne ; 2006-2015) , en partenariat avec Conception, synthèse et vectorisation de biomolécules (Paris) (laboratoire) .

Le jury était composé de Marie-Paule Teulade-Fichou, Geneviève Pratviel, Sylvain Ladame, Valérie Gabelica, Sophie Bombard, Casimir Blonsky.

Les rapporteurs étaient Geneviève Pratviel, Sylvain Ladame.

mots clés

• Acides nucléiques
• ADN
• ARN
• G-quadruplexes
• Métaux de transition
• Hétérocycles
• FRET
• Spectrométrie de masse
• FID
• Haut-débit
• Criblage
• Fluorescence
• Reconnaissance moléculaire
• Sondes à acide nucléique
• Fluorescence
• Métaux de transition -- Complexes
• Criblage pharmacologique

Résumé

L’objectif de ces travaux de thèse était l’étude des interactions de petites molécules avec les multiples structures de l’ADN quadruplex via i) le développement et l’utilisation d’un test haut-débit pour l’analyse des interactions ligand-ADN quadruplex et le criblage de chimiothèques/ciblothèques et ii) la préparation de composés aux modes d’interactions multiples (empilement/sillon, covalent/non-covalent, etc.), sélectifs (quadruplex vs. duplex et intra-quadruplex) et éventuellement fonctionnalisés (biotine, fluorophore, etc.). La première partie des travaux a été centrée sur le développement du test G4-FID (G-quadruplex Fluorescent Intercalator Displacement) qui est une méthode semi-quantitative permettant l’évaluation de l’affinité et de la sélectivité de petites molécules pour l’ADN quadruplex par déplacement d’une sonde off/on, le Thiazole Orange (TO). Le test a notamment été transposé avec succès de la cuve vers la microplaque (HT-G4-FID). D’autre part, nous avons montré l’intérêt de fluorophores alternatifs, TO-PRO-3 et Hoechst 33258, aux caractéristiques spectrales complémentaires à TO. Cette méthode d’analyse a également été utilisée avec succès pour l’identification de nouveaux ligands sélectifs d’ADN quadruplex et la mise en évidence des relations structure-activité ainsi que des sélectivités structurales. La deuxième partie des travaux a été consacrée à la préparation et à l’étude de nouveaux ligands d’ADN quadruplex. Ces ligands possèdent des particularités, soit dans leur mode d’interaction (sillons, coordination) soit par leur bifonctionnalité (biotinylés, fluorescents). Nous avons ainsi préparé un ligand de quadruplex polyhétéroaryle acyclique (TOxaPy) possédant une sélectivité inattendue pour certaines structures de l’ADN quadruplex. D’autre part, nous avons montré que les complexes de dérivés de terpyridine peuvent être adaptés, en changeant le ligand organique et/ou la nature du métal, de façon à interagir avec l’ADN quadruplex par interaction covalentes et/ou non covalentes.

mots clés

• Nucleic acids
• DNA
• RNA
• G-quadruplexes
• Transition metals
• Heterocycles
• FRET
• Mass spectrometry
• FID Assay
• High-throughput
• Screening
• Fluorescence
• Molecular recognition

Titre traduit

G-quadruplex Nucleic Acids Targeting : synthesis and Method Development for the Analysis and Screening of Selective Multimodal Ligands

Résumé

The aim of this thesis work was to study the interactions of small molecules with multiple structures of quadruplex DNA via i) the development and use of a high-throughput test for the analysis of ligand-quadruplex DNA interactions and screening of chemical libraries and ii) the preparation of compounds with multiple binding modes (stacking/groove, covalent/non-covalent, etc..) selective (quadruplex vs. duplex and intra-quadruplex) and possibly functionalized (biotin, fluorophore, etc.). The first part of the work was focused on the development of the G4-FID (G-quadruplex Intercalator Fluorescent Displacement) assay, which is a semi-quantitative method for evaluating the affinity and selectivity of small molecules for quadruplex DNA by displacing an off/on probe, the Thiazole Orange (TO). The test has been implemented successfully with microplate (HT-G4-FID). On the other hand, we have shown the importance of alternative fluorophores, TO-PRO-3 and Hoechst 33258, with complementary spectral characteristics. This method of analysis has also been successfully used for the identification of new selective ligands of quadruplex DNA and the identification of structure-activity relationships and structural selectivities. The second part of the work was devoted to the preparation and study of new DNA quadruplex ligands. These ligands possess particular characteristics either in their mode of interaction (grooves, coordination) or by their bifunctionality (biotinylated, fluorescent). We have prepared an acyclic polyheteroaryle quadruplex ligand (TOxaPy) with an unexpected selectivity for certain structures of quadruplex DNA. Furthermore, we showed that complexes of terpyridine derivatives can be tailored by changing the organic ligand and / or the metal in order to interact with quadruplex DNA by covalent and / or non-covalent interaction.