Peptides vecteurs et protéomique intracellulaire : détection de phosphorylations par spectrométrie de masse MALDI-TOF

Cell penetrating peptides and intracellular proteomics : detection of phosphorylations by MALDI-Tof mass spectrometry

• Auteur / Autrice : Lucrèce Matheron
• Direction : Gérard Bolbach
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine kinase C

Dérivatisation (chimie)

Chromatographie d'affinité

Peptides

Phosphorylation

Résumé

Les peptides vecteurs (CPP) peuvent traverser les membranes cellulaires et y vectoriser des molécules. Ce projet a pour but le développement d’un test pour évaluer la capacité d’un CPP à atteindre le cytoplasme. Le CPP est couplé à une cargaison substrat d’une enzyme uniquement cytoplasmique, la Protéine Kinase C (PKC). Après lyse cellulaire la détection d’une phosphorylation de cette cargaison par MALDI-TOF révèle une localisation cytoplasmique. La détection des phosphopeptides par spectrométrie de masse n’est pas triviale. Nous avons évalué deux stratégies pour la faciliter. 1) purification sélective des peptides phosphorylés, en utilisant des matériaux chromatographiques dédiés. Cette stratégie s’est révélée inappropriée pour ces phosphopeptides fortement basiques, malgré diverses optimisations de séquences. 2) dérivation chimique où le phosphate est éliminé et remplacé par un groupement favorable à l’ionisation en MALDI-TOF. Cette stratégie s’est également révélée peu efficace, malgré une forte amélioration des limites de détection, à cause de nombreuses réactions secondaires. En particulier, le peptide non phosphorylé est également réactif et peut générer les mêmes produits que le phosphopeptide, ce qui empêche de les distinguer. Par ailleurs, de nombreuses conditions expérimentales ont été testées in cellulo. La phosphorylation de la cargaison a pu être mise en évidence, mais dans des conditions très précises, et n’est pour l’instant pas observée dans les cellules vivantes (non lysées). Ce travail sera poursuivi, notamment par l’utilisation d’un anticorps commercial dirigé contre la séquence phosphorylée de ce substrat de PKC.