Evaluation d’un effet anti-apoptotique du fibroblaste gingival et étude des mécanismes impliqués : contribution au développement d’une thérapie cellulaire de l’anévrisme de l’aorte abdominale

Evaluation of an anti-apoptotic effect of gingival fibroblasts and analysis of the mechanisms involved : contribution to the development of cell therapy of abdominal aortic aneurysm

• Auteur / Autrice : Li Li
• Direction : Bernard Coulomb
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Paris 5

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine Bax

Facteur de croissance transformant bêta-1

Inhibiteur tissulaire de métalloprotéinase-1

Malformation congénitale kystique adénomatoïde du poumon

physiologie

Apoptose

Maladies de la gencive

Biologie cellulaire

Anévrisme de l'aorte

Apoptose

Gencives -- Maladies

Cytologie

Fibroblastes

Résumé

L’anévrisme de l’aorte abdominale est une pathologie vasculaire qui se caractérise par une dégradation de la matrice extracellulaire et s’accompagne d'une diminution du nombre de cellules musculaires lisses (CML). Les travaux précédents du laboratoire ont montré dans un modèle de culture d'artère ex vivo que le fibroblaste gingival (FG) inhibe la dégradation des fibres élastiques. Cet effet est lié à une stimulation par le fibroblaste gingival de la synthèse de TIMP-1 par les CML de la paroi aortique (Gogly, 2007). Dans le but de développer une thérapie cellulaire avec les FGs, il est donc important de savoir si FGs ont aussi un effet protecteur pour les cellules de la paroi artérielle. Nous avons d’abord montré que la présence de FG en co-culture avec des fragments d'aortes, conduit à une diminution du nombre de cellules en apoptose dans la paroi aortique. Le milieu conditionné par les FGs a un effet similaire. Pour étudier les mécanismes de cet effet anti-apoptotique, nous avons utilisé des cellules en monocouche (une lignée de fibroblaste humain Wi26 et des HUVEC). Les FGs inhibent l’activité des Caspases 3 et 9. L’inhibition de l’activité de la Caspase 9 a démontré que les FGs modulent la voie mitochondriale de l'apoptose. Ceci est confirmé par les études du potentiel membranaire mitochondrial (Δψm) et de la libération du cytochrome c. L'analyse de l'expression des protéines pro- (Bax) et anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xl, Hsp27) par Western blots a aussi montré une augmentation de l’expression de Bcl-2 et une inhibition de Bax. Nous avons également montré que la surexpression de Bcl-2 induite par le milieu conditionné par les FGs passe par la voie de signalisation FAK/Pi3K, et une induction de la phosphorylation de la MAP Kinase Erk1/2. Enfin, parmi les différents facteurs sécrétés par les FGs nous avons analysé les effets du TIMP-1 et du TGF-beta1 en utilisant des anticorps bloquants. Les résultats ont montré une inhibition de l'expression de Bcl-2 par l’anticorps anti-TIMP-1 et une inhibition de l'expression de Bcl-2 accompagné d’une diminution de la phosphorylation de Erk1/2 par l’anticorps anti-TGF-beta1. Le TIMP-1 et le TGF-beta1 contribuent donc, au moins en partie, aux effets antiapoptotiques des FGs. Ce travail de recherche nous permet d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’inhibition du processus apoptotique par les FGs, et contribue au développement d’une nouvelle stratégie de thérapie cellulaire basée sur l'utilisation de fibroblastes gingivaux.

The abdominal aortic aneurysm is a vascular disease characterized by a degradation of the extracellular matrix. It is accompanied by a decrease of smooth muscle cells (SMCs). Previous work performed in the laboratory showed that the gingival fibroblast (GF) inhibits the degradation of elastic fibers in an ex vivo artery culture model. This effect is linked to the stimulation of the synthesis of TIMP-1 by SMCs of the aortic wall by gingival fibroblast (Gogly, 2007). In order to contribute to the development of a cell therapy with GFs, it is important to know whether GFs also have a protective effect on the arterial wall cells. We first showed that the presence of GFs in co-culture with fragments of aorta, lead to a decrease of the number of apoptotic cells in the aortic wall. The treatment of aorta segments with GFs conditioned medium gave similar results. To study the mechanisms of this anti-apoptotic effect, we used cells in monolayer (a line of human fibroblast Wi26 and HUVEC). The GFs inhibit the activity of caspases 3 and 9. The inhibition of the caspase 9 activity showed that GFs modulate the mitochondrial pathway of apoptosis. This is confirmed by studies of mitochondrial membrane potential (Δψm) and the release of cytochrome c. The analysis of pro- (Bax) and anti-apoptotic (Bcl-2, Bcl-xl, Hsp27) protein expression also showed an increase of the expression of Bcl-2 and an inhibition of Bax. Next, we showed that overexpression of Bcl-2 by the GFs conditioned medium go through the FAK/Pi3K signaling pathway and the induction of phosphorylation of MAP kinase Erk1 / 2. Finally, among the various factors secreted by the GFs, we analysed the effects of TIMP-1 and TGF-beta1 using blocking antibodies. The results showed an inhibition of the expression of Bcl-2 by anti-TIMP-1 and an inhibition of the expression of Bcl-2 accompanied by a decrease of the phosphorylation of Erk1 / 2 by the antibody anti-TGF-beta1. Therefore the TIMP-1 and the TGF-beta1 contribute, at least partially, to the anti-apoptotic effects of GFs. Thus, this research permits to have a better understanding of the mechanisms of these anti-apoptotic effects of GFs and contributes to the development of a new cell therapy strategy based on GFs.