Méthodes de transfert de gènes non virales : application aux pathologies tendineuses

Non viral gene tranfer methods : application to tendinopathy

• Auteur / Autrice : Anthony Delalande
• Direction : Chantal Pichon, Ayache Bouakaz
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 22/06/2011
• Etablissement(s) : Orléans
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences et technologies (Orléans ; 2009-2012)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....)
• Jury : Président / Présidente : Claudine Kieda
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Chantal Pichon, Claudine Kieda, Elias Fattal, Delphine Duprez, Michel Postema
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Elias Fattal, Delphine Duprez

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ultrasonothérapie

Silice

Transfert génétique

Thérapie génique

Ténopathies

Tendons

Mots clés libres

Tendons

Transfert de gène

Silice

Sonoporation

Microbulles

Ultrasons

Tendons

Gene transfer

Silica

Sonoporation

Microbubbles

Ultrasound

Résumé

Le tendon est un organe impliqué dans de nombreux troubles musculo squelettiques. Les connaissances des différentes molécules impliquées dans la biologie des tendons permettent d’envisager des traitements par thérapie génique. L'objectif de cette thèse a été d'évaluer la faisabilité de transférer des gènes dans les tendons par deux méthodes non virales : une méthode chimique utilisant des nanoparticules de silice mésoporeuses et une méthode physique reposant sur l’utilisation des ultrasons et des microbulles de gaz (sonoporation). Dans une première étude, nous avons montré que des nanoparticules de silice mésoporeuses sont capables de transférer efficacement des gènes dans le tendon d’Achille de rat. Celles-ci ont été utilisées pour transférer le gène du facteur de croissance PDGF dans des tendons lésés. Nos résultats indiquent une accélération de la réparation du tendon lésé. Dans une deuxième étude, nous avons utilisé la sonoporation, technique jamais appliquée aux tendons. Nous avons déterminé les paramètres acoustiques permettant un transfert de gènes efficace dans le tendon d'Achille de souris. Une expression stable d’un transgène a été maintenue pendant 100 jours suite à une injection locale d’ADN en présence de microbulles de gaz. Nous avons ensuite utilisé cette méthode dans un modèle de souris transgénique invalidée pour le gène de la fibromoduline possédant des fibres de collagène anormales. Une restauration remarquable du phénotype de ces souris a été observée suite au transfert du gène de la fibromoduline. Nous avons ensuite étudié les interactions entre les microbulles, la membrane plasmique et le transfert de gènes dans les cellules sous ultrasons. Ces études ont permis d’identifier pour la première fois, une pénétration des microbulles de gaz dans la cellule et un trafic intracellulaire de l’ADN impliquant la voie d’endocytose clathrine dépendante. En conclusion, les deux méthodes de transfert de gènes non virales ont permis de transfecter des gènes efficacement dans les tendons. Ces résultats prometteurs permettent d’envisager leur exploitation pour des applications thérapeutiques dans les pathologies tendineuses.

Tendons are often involved in many musculoskeletal disorders. Knowledge of the different molecules involved in tendons biology allows to consider treatments based on gene therapy. The goal of my work was to evaluate the feasibility of gene transfer in tendons by using two non-viral methods: mesoporous silica nanoparticles and a physical method based on ultrasound-assisted gas microbubbles (sonoporation). In the first study, we showed that mesoporous silica nanoparticles could efficiently transfer genes in rat Achilles tendon. They were used to transfer plasmid DNA encoding PDGF growth factor gene in injured tendons. Data demonstrated that DNA/MSN complexes have improved the healing of injured tendons. In the second study, we used the sonoporation method which has never been applied to the tendons. First, we determined the acoustic parameters for gene transfer in mice Achilles tendon. A stable expression of the transgene was maintained up to 100 days following one local injection of DNA in the presence of gas microbubbles. We then used this method to restore the fibromodulin knocked out gene in a transgenic mouse model having disorganized collagen fibers in tendons. Following the transfer of fibromodulin gene, a remarkable restoration of collagen fibers in these mice was observed. In the last part, we studied the interactions of microbubbles with the plasma membrane and the plasmid DNA internalization into the cells by sonoporation. These studies have identified for the first time a rapid penetration of gas microbubbles inside the cell and an intracellular routing of DNA involving the clathrinmediated endocytosis pathway. In conclusion, both methods of non viral gene transfer led to an efficient gene transfer in tendons. These promising results obtained during this project allow considering their use for therapeutic applications in tendon diseases.