Système autolytique de Lactobacillus helveticus

• Auteur / Autrice : Iva Jebava Ondrackova
• Direction : Milada Plockova, Lortal Sylvie
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie. Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Rennes, Agrocampus Ouest

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes

Lactobacillus helveticus

Résumé

L´autolyse est une dégradation du peptidoglycan par des enzymes bactériennes endogènes appelées hydrolases du peptidoglycane ou autolysines. Grâce à cette réaction enzymatique, la cellule bactérienne peut éclater et le contenu intracellulaire est libéré. Chez Lactobacillus helveticus, le ferment protéolytique fromager, les enzymes libérées lors de l´autolyse jouent un rôle important dans le développement de l´arôme et la texture des fromages au cours de l´affinage. Il apparait également que l´autolyse accélère l´affinage de fromage, un processus long et coûteux. Il a été démontré que l´aptitude à l´autolyse était un facteur souche dépendant mais les mécanismes à l´origine de cette diversité n´ont pas été élucidés. L´objectif de ce travail est de comprendre pourquoi les souches de L. Helveticus s´autolysent de manière différente. Nous avons élaboré la stratégie suivante : (i) construire une collection de L. Helveticus la plus diverse possible, (ii) rechercher l´origine de la diversité autolytique au niveau génétique et (iii) déterminer le rôle de la paroi cellulaire. Une collection de référence composée de 26 souches de L. Helveticus a été constituée de manière à offrir la plus large diversité possible en termes d´origine géographique et de biotope. La diversité des souches au niveau génomique a été confirmée par électrophorèse en champ pulsé. Le suivi de l´autolyse réalisé en tampon, par microscopie électronique, coloration de Gram et cytometrie en flux, et en milieu fromager modèle ont montré que les souches se distinguent pour leur capacité autolytique. Pour étudier la diversité génétique dans la collection de référence nous nous sommes appuyé sur le génome séquencé de la souche autolytique L. Helveticus DPC 4571. Neuf couple d´amorces, correspondant aux neuf gènes codant pour les autolysines prédits chez la souche DPC 4571, ont été dessinés et validés. La présence des gènes codant pour les autolysines ainsi que leur transcription ont été recherchées par PCR et RT-PCR chez les 26 souches. La technique de zymogramme a été utilisée d´une part pour rechercher l´activité enzymatique des autolysines et d´autre part pour rechercher la diversité des parois cellulaires. Puis la diversité des parois cellulaires parmi les souches de L. Helveticus a été étudiée par analyse des acides teïchoiques et par analyse d´activité enzymatique sur différents substrats par zymogramme. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont permis de comprendre que la diversité autolytique n´est pas due à une variabilité du nombre des gènes codant pour les autolysines ni à leur transcription. Nous montrons ainsi que ce sont des étapes de traduction et/ou modification post-traductionnelle qui peuvent jouer un rôle dans la diversité autolytique. La composition de l´acide teïchoique varie d´une souche à l´autre ce qui montre une diversité parmi les souches au niveau de la paroi cellulaire. De plus, il a été montré que la cytométrie en flux peut être utilisée pour la mesure de l´autolyse in vitro.

Autolysis results from peptidoglycan degradation, by so called endogenous peptidoglycan hydrolases or autolysins, leading to disintegration of the bacterial cell which causes release of intracellular content. In case of L. Helveticus, a dairy starter culture uses for cheesemaking, released enzymes by autolysis involves a development of sensory properties and accelerates cheese ripening. It was shown that L. Helveticus autolysis is a strain-dependant phenomenon. The aim of this work was to determine the origin of autolytic diversity of L. Helveticus. Following strategy was elaborated: (i) construction of a collection of L. Helveticus strains, (ii) evaluation of the diversity for autolytic genes, and (iii) determination of the role of the cell wall. A collection of 26 stains of L. Helveticus, diverse in terms of origin and biotope, was assembled. Pulsed field gel electrophoresis was applied to assess the genomic diversity of all tested strains. Autolytic capacity was evaluated in vitro in buffers (by electron microscopy, Gram staining, flow cytometry) and in situ in a model cheese. Nine genes coding PGHs were previously annotated in the genome of the high autolytic strain L. Helveticus DPC 4571. Nine pairs of primers, corresponding to the nine PGHs genes, were designed and validated against DPC 4571. Distribution of the genes coding for autolysins were tested in 26 strains by PCR and RT-PCR. Zymogram was used to detect enzymatic activity of autolysins and also for observed the diversity of the cell wall. The difference in composition of the cell wall among six selected strains was accomplished by analysis of teichoic acid and by zymogram using different substrates. The nine PGHs genes are ubiquitous and transcribed early during growth. Zymograms were similar in terms of molecular size of the bands, but exhibited strain to strain variations in the number of bands revealing from 2 to 5 lytic bands per strain. Composition of teichoic acid varied from strain to strain. The work realized during this thesis permitted to understand that the autolytic diversity does not depend on the distribution of autolysins, not even to their transcription. These results indicate that the origin of the autolytic diversity could be due to post-translation steps or to the regulation of peptidoglycan hydrolases, or to the composition of the cell wall. In addition, it was shown that flow cytometry could be used for the determination of autolysis in vitro.