Étude de la mort hépatocytaire associée à la stéatohépatite non alcoolique : implication de l'autophagie

Study of hepatocyte death in non alcoholic steatohepatitis : role of autophagy

• Auteur / Autrice : Vanessa Lavallard
• Direction : Philippe Gual, Albert Tran
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions moléculaires et cellulaires
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Nice
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hépatite

Mort cellulaire

Cellules hépatiques

Stéatose hépatique

Mots clés libres

Autophagie

Palmitate

Résumé

L’obésité s’accompagne d’un large spectre de complications hépatiques, nommées maladies du foie gras non alcooliques, allant d’une stéatose (accumulation de triglycérides dans le foie à) à une inflammation (NASH : stéatohépatite non alcoolique) et pouvant évoluer vers la fibrose, la cirrhose voire l’hépatocarcinome. La NASH est caractérisée par un foie gras, une inflammation hépatique et une importante mort hépatocytaire (nécro-inflammation). Le même spectre d’altérations est présent dans les maladies alcooliques du foie. Les mécanismes impliqués dans l’évolution de la stéatose à l’inflammation puis à la fibrose restent complexes. Parmi les facteurs, l’endotoxémie métabolique et la mort hépatocytaire pourraient jouer un rôle important. L’augmentation du LPS circulant due à des modifications de la perméabilité intestinale active l’inflammation hépatique, qui, par conséquent, induit la nécro-inflammation et la fibrose. L’apoptose des hépatocytes augmente aussi l’inflammation et la fibrose. Ainsi, améliorer la survie cellulaire pourrait être une cible thérapeutique pour prévenir l’évolution des complications hépatiques. L’étude de cette mort hépatocytaire dans les complications hépatiques de l’obésité a permis de déterminer que les marqueurs sériques de mort hépatocytaire sont des marqueurs prédictifs de l’inflammation hépatique. A ce jour, seule la biopsie hépatique, technique invasive, permet de diagnostiquer l’inflammation hépatique. Identifier des marqueurs non invasifs prédictifs de cette inflammation constitue un réel besoin en clinique. Notre premier projet a consisté à déterminer si les marqueurs sériques de mort hépatocytaire pouvaient constituer des marqueurs prédictifs de l’inflammation dans les maladies chroniques du foie induite par l’obésité et l’alcool. Dans des cohortes de patients obèses morbides et alcooliques, nous avons montré que le niveau circulant des marqueurs apoptotiques est augmenté lors de l’inflammation hépatique. Ces marqueurs sont aussi prédictifs de la fibrose chez les patients alcooliques. De plus, l’association du marqueur d’apoptose hépatocytaire avec les ALAT et le syndrome métabolique améliore la prédiction de l’inflammation hépatique chez des patients obèses. L’inflammation régule négativement le rôle hépato-protecteur de l’autophagie. De récentes études ont rapporté que l’autophagie pouvait jouer un rôle hépato-protecteur. Dans ce deuxième projet, nous avons déterminé le niveau d’activation du flux autophagique et son rôle dans la souffrance hépatocytaire associée à la NASH. Dans des modèles murins de NASH (régime déficient en méthionine et choline, souris obèses traitées au LPS), l’inflammation hépatique est associée à une diminution du flux autophagique (évalué par le niveau de la protéine p62) et à une augmentation de la souffrance hépatocytaire. L’activation (mise à jeun) ou l’inhibition du flux autophagique (adénovirus shATG7) diminue ou augmente respectivement les lésions hépatiques induites par l’inflammation. Dans des hépatocytes primaires de souris, le flux autophagique est bien diminué en réponse au TNFα et à l’IL1β. L’inhibition de l’autophagie augmente aussi la mort des cellules HepG2 induite par le TNFα et l’IL1β. Dans le foie de patients obèses, le niveau d’expression des marqueurs de l’autophagie est augmenté et corrélé avec le niveau des ALAT. L’accumulation d’autophagosomes et de p62 suggèrent une altération du flux autophagique. Nous avons donc montré que l’inflammation hépatique, en inhibant le flux autophagique, pourrait favoriser la mort cellulaire associée à la NASH. La lipotoxicité induite par le palmitate active l’autophagie dans les cellules HepG2. L’obésité est associée à une augmentation des acides gras libres saturés, dont le palmitate, responsables de la lipotoxicité. Cependant, le palmitate active aussi l’autophagie dans les différents types cellulaires. L’objectif était de déterminer si le palmitate pouvait réguler l’autophagie dans les cellules HepG2 et déterminer son rôle dans la lipotoxicité. Nous avons montré que le palmitate active l’autophagie par une voie indépendante du TNFα et des céramides et partiellement dépendante des JNKs. L’inhibition de l’autophagie augmente la mort cellulaire induite par le palmitate. Par contre, un acide gras insaturé non lipotoxique comme l’acide oléique n’induit pas l’autophagie mais prévient la lipotoxicité et l’activation du flux autophagique induits par le palmitate. En conclusion, l’activation de l’autophagie joue un rôle hépato-protecteur mais son niveau d’activation est insuffisant pour prévenir l’induction de la lipoapoptose par le palmitate. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier des nouveaux acteurs potentiellement impliqués dans la pathogenèse des complications hépatiques de l’obésité.

Obesity is associated with a large spectrum of hepatic complications called non alcoholic fatty liver diseases. They evolve from steatosis (hepatic accumulation of triglycerides) to inflammation (NASH : non alcoholic steatohepatitis) which can progress to fibrosis, cirrhosis and hepatocarninoma. NASH is characterized by fatty liver, hepatic inflammation and hepatocyte death (necro-inflammation). Alcoholic liver diseases share the same spectrum of hepatic alterations. The mechanisms involved in the evolution from steatosis to inflammation and then fibrosis are complex. Among the several factors, metabolic endotoxinemia and hepatocyte death could play an important role. The increase in circulating LPS level due to the modifications of intestinal permeability activates hepatic inflammation which induces necro-inflammation and fibrosis. Hepatocyte apoptosis also increases inflammation and fibrosis. So, improving cell survival could be a therapeutic target to prevent evolution of hepatic complications. The study of this hepatocyte death in hepatic complications in obesity determined : i) Serum hepatocyte death markers levels predict hepatic inflammation. Hepatic biopsy, an invasive approach, remains the gold standard for assessment of liver inflammation? Identifying non invasive markers is a real need for clinical. Our first goal was to determine whether serum markers of hepatocyte death could predict hepatic inflammation in chronic liver diseases associated to obesity and chronic alcohol consumption. In morbidly obese and alcoholic patients, we have reported that the circulating level of apoptotic markers significantly increased with hepatic inflammation. These markers also predict hepatic fibrosis in alcoholic patients. Further, association of apoptotic hepatocyte marker with ALT and metabolic syndrome improves prediction of hepatic inflammation in morbidly obese patients. Ii) Inflammation negatively regulates the hepato-protective role of autophagy. Studies have recently reported that autophagy could play an hepato-protective role. In our second project, we have determined the role of inflammation in hepatic autophagic turnover and cell death. In mouse models of NASH (menthionine choline deficient-diet, obese mice upon LPS challenge), hepatic inflammation is associated with a decrease in autophagic flux and an increase in hepatocyte suffering. Activation (fasting) or inhibition of autophagic flux decreases or increases liver injury induced by inflammation, respectively. In mouse primary hepatocytes, autophagic flux is decreased in response to TNFα and IL1β. The inhibition of autophagic flux also enhances HepG2 cells death induced by TNFα and IL1β. In obese patients, hepatic expression level of autophagic markers is increased and correlated with ALT level. Autophagosomes and p62 accumulation suggest an alteration of autophagic flux. We have therefore shown that hepatic inflammation decreases hepatic autophagic turnover and enhances liver injury in steatotic liver associated with obesity. Iii) Autophagy is activated for cell survival after lipoapotosis in HepG2 cells. Obesity is associated with elevated free saturated fatty acids, such as palmitate, which are involved in lipotoxicity and lipoapoptosis in liver cells. Palmitate also regulates autophagy leading to either cell death or survival in other cells. The objective of the last study was to determine if palmitate regulates autophagic turnover and to evaluate its role in lipotoxicity in HepG2 cells. Palmitate induces autophagic turnover independently of TNFα and ceramides and partially dependent on JNK activation. The inhibition of autophagy enhances cell death induced by palmitate. In addition, treatment of cells with an unsaturated fatty acid (oleic acid) prevented the activation of JNK, autophagic flux partially via the JNK pathway in HepG2 cells. The induction of autophagy played a protective role but the level of activation of this compensatory effect was insufficient to completely prevent lipoapoptosis. Our studies highlight new potentially actors involved in the pathogenesis of hepatic complications in obesity.