Etude de profils métaboliques dans les cellules de culture humaine par spectroscopie isotopique : application pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques

Metabolic profiling studies of mammalian culture cells by isotopic spectroscopy : application for discovering new therapeutic targets

• Auteur / Autrice : Estelle Martineau
• Direction : Serge Akoka, Illa Tea, Patrick Giraudeau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Matériaux, Matières, Molécules en Pays de la Loire (3MPL) (Le Mans2008-2021)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Nantes. Faculté des sciences et des techniques

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cancer du sein

Cultures cellulaires

Mots clés libres

Rmn 2d

Métabonomique

Extraction

Smri

Résumé

L'étude des métabolites en milieu complexe par RMN et SMRI est extrêmement prometteuse pour le développement d'outils pour le dépistage du cancer du sein. Toutefois, la quantification des métabolites intracellulaires par RMN 1D est limitée par les recouvrements entre pics. La RMN 2D semble être une solution à ce problème mais les longues durées expérimentales restreignent son usage à des fins quantitatives. Par ailleurs, la SMRI n'a jamais été envisagée jusqu'à présent pour différencier des cellules cancéreuses. L'objectif de cette thèse est d'établir des profils isotopiques et métaboliques de ces cellules par RMN et SMRI. Une première approche consiste en une optimisation d'expériences de RMN 2D afin d'évaluer leurs potentialités pour obtenir des analyses quantitatives rapides et précises. La séquence INADEQUATE-1H permet, après optimisation, l'acquisition de spectres quantitatifs en 7 minutes avec une excellente linéarité et une répétabilité inférieure à 2%. En parallèle, une stratégie de comparaison des méthodes d'extraction est développée afin de choisir la plus robuste et répétable pour l'analyse métabolomique par RMN des cellules du cancer du sein. En couplant la méthode d'extraction choisie à la RMN 2D optimisée, la concentration absolue des métabolites est déterminée avec précision sur plusieurs lignées cancéreuses par une méthode d'ajouts dosés. Une seconde approche concerne la mise au point d'un outil de différenciation cellulaire par SMRI. La mesure des rapports isotopiques 15N/14N et 13C/12C permet d'établir une signature caractéristique de chaque lignée cellulaire et d'élaborer une carte isotopique discriminante de différents types de cancer du sein.

Metabolic studies in complex media by NMR and IRMS are highly promising towards the development of tools for breast cancer screening. Howewer, the quantification of intracellular metabolites by 1D NMR is limited by overlaps between peaks. 2D NMR offers a solution but suffers from long experiment durations which limit its quantitative use. On the other hand, IRMS has never been used to differenciate cancer cells. This work aims at establishing isotopic and metabolic profiles of these cells by NMR and IRMS. A first approach consists in optimizing 2D NMR sequences in order to estimate their potentialities for fast and precise quantitative analysis. Once optimized, the 1H INADEQUATE, sequence leads to quantitative spectra in 7 minutes with an excellent linearity and a repeatability better than 2%. Moreover, a comparison strategy of extraction methods is developed in order to determine the most robust and repeatable one for metabolomic studies of breast cancer cells. By coupling the optimum extraction method with the optimized 2D NMR protocol, the absolute metabolite concentrations are precisely determined on several cancer cell lines by a standard additions method. A second approach deals with the development of a cellular differentiation method by IRMS. The measurement of 15N/14N and 13C/12C isotopic ratios makes it possible to determine a characteristic isotopic signature of each cell line, and to draw up an isotopic map which discriminates between breast cancer cell lines.