Vglut3 : un rôle essentiel dans la cochlée et implication dans la surdité DFNA25.

Vglut3 : an essential role in cochlea and implication in deafness DFNA25.

• Auteur / Autrice : Tiphaine Bersot
• Direction : Michel Eybalin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 19/12/2011
• Etablissement(s) : Montpellier 2
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; ....-2014)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : U 1051 - INM - Physiopathologie et thérapie des déficits sensoriels et moteurs
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michel Eybalin, Salah El mestikawy, Jean-luc Puel, Michel Vignes
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Gasnier, Philippe Lefevbre

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transmission nerveuse

Surdité -- Génétique

Cochlée

Mots clés libres

Cochlée

Transporteur vésiculaire du glutamate

Neurotransmission glutamatergique

Cellules ciliées internes

Surdité génétique

Audition

Cochlea

Vesicular glutamate transporter

Glutamatergic neurotransmission

Inner hair cells

Genetic deafness

Hearing

Résumé

Avant sa libération, le glutamate est accumulé dans des vésicules synaptiques par trois transporteurs vésiculaires (VGLUT1-3). Les cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée n'expriment que VGLUT3. Pour étudier son rôle dans la physiologie cochléaire, nous avons utilisé une lignée de souris dont le gène Slc17a8, qui code pour VGLUT3, a été invalidé par recombinaison homologue. Les mutants ne présentaient pas de réponse nerveuse à une stimulation sonore. Les mécanismes d'exocytose des CCI étaient normaux et leurs synapses normales en microscopie électronique. Des immunoblots montraient que le transporteur membranaire du glutamate GLAST, ainsi que les sous-unités GLUR2 et NR1 des récepteurs AMPA et NMDA étaient toujours exprimées. Enfin, des potentiels auditifs du tronc cérébral étaient enregistrés après une stimulation électrique au niveau de la fenêtre ronde. Toutefois, nos résultats indiquent des diminutions de ~50% des synapses afférentes et de ~40% des neurones auditifs primaires ainsi qu'une réduction importante des terminaisons efférentes latérales sous les CCI.SLC17A8 est responsable de la surdité de perception non syndromique dominante DFNA25. Nous avons identifié une mutation dans l'exon 5 conduisant au remplacement de l'Alanine211 en Valine. Cette Alanine est conservée dans les VGLUT3 de différentes espèces ainsi que dans les VGLUT1-3 humains, suggérant un rôle fonctionnel important pour cet acide aminé. Nous avons caractérisé les propriétés biochimiques de la mutation A211V en culture de cellules. Le transporteur muté était correctement adressé aux boutons présynaptiques. Cependant, la mutation pA211V entraîne un défaut d'expression important en partie expliqué par le fait que le codon codant la valine est un codon rare. De plus, les études du transport de glutamate ont montré que la forme mutée est hyperactive par rapport à la forme native. L'ensemble de ces résultats montre que la mutation entraine un phénotype cellulaire complexe.

Before its release, glutamate is accumulated into synaptic vesicles by three vesicular glutamate transporters (VGLUT1-3). Only VGLUT3 is expressed in the inner hair cells (IHCs) of the cochlea. To study its role in the hearing physiology, we used a mouse in which the Slc17a8 gene, which encodes VGLUT3, has been null-mutated. In this VGLUT3-/- mouse, no auditory nerve response to acoustic stimuli could be recorded. All the others cochlear potentials were normal. The genetic deletion of Slc17a8 in mice resulted in a profound deafness, without altering the IHCs synapse morphology and the synaptic vesicles turnover. Using western blot, we then observed that the glutamate-aspartate transporter GLAST and the GLUR2 and NR1 subunits of AMPA and NMDA receptors were always expressed. Finally, auditory brainstem responses could be elicited by electrical stimuli on the round window. However, VGLUT3-/- IHCs presented a ~50% loss of IHCs synapses and a ~40% loss of primary auditory neurons. The number of lateral olivocochlear synapses with primary auditory neurons dendrites was strongly reduced.The SLC17A8 gene is responsible for DFNA25, an autosomal dominant progressive, high-frequency nonsyndromic deafness. We identified a heterozygous non-synonymous missense mutation in exon 5, leading to the amino acid change p.A211V. The A211 residue is conserved in VGLUT3 across species and in all the human VGLUT subtypes (VGLUT1-3), suggesting an important functional role. We characterized the biochemical properties of the A211V mutation in cell culture. Our results suggest that the mutated VGLUT3 was correctly addressed at the presynaptic boutons. However, the pA211V mutation induced an expression decrease because the valine codon is a rare codon. Moreover, the glutamate uptake is increased with the mutated VGLUT3. All these results shows that this mutation involves a complex cellular phenotype.