Etude de la régulation du gène Sox2 dans la niche neurogénique par les hormones thyroïdiennes et leur récepteur TRα1 : applications in vivo de méthodes de transfection du siRNA par lipides monocationiques (INTERFERinTM)

• Auteur / Autrice : Silvia Alejandra Lopez Juarez
• Direction : Barbara Demeneix, Ghislaine Dubois Morvan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire, mention physiologie
• Date : Soutenance en 2011
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris ; 1995-....)
• Jury : Président / Présidente : Michelina Plateroti
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrick Erbacher
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Harold Cremer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Développement neurologique

Cellules souches neurales

Hormones thyroïdiennes

Résumé

La découverte des cellules souches neurales (CSN) dans le cerveau adulte a ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives. Pour cette raison, à l’heure actuelle, les mécanismes qui régulent les processus de renouvellement, différenciation et migration des cellules souches neurales sont activement étudiés. Afin d’étudier les mécanismes de régulation des gènes impliqués dans ces processus, l’inhibition d’un gène cible par l’effet RNA interférence est un outil de choix. Cependant, un des défits majeurs de la vectorisation des siRNA in vivo réside à délivrer des siRNA fonctionnels dans une population cellulaire spécifique. En collaboration avec l’entreprise Polyplus-transfection, nous avons mis au point la vectorisation des siRNA in vivo à l’aide d’un vecteur non viral à base de lipides monocationiques commercialisé sous le nom « INTERFERinTM ». Cet outil a été testé dans l’une des deux principales niches neurogéniques du cerveau de souris adulte : la zone subventriculaire (ZSV). Nous avons ainsi montré que l’INTERFERinTM est efficace pour inhiber l’expression d’un gène essentiel au maintien du pool des CSN : Sox2, dont l’expression est restreinte aux CSN et progéniteurs de la ZSV. Par ailleurs, les hormones thyroïdiennes jouent un rôle crucial dans la prolifération des CSN. Nous avons ainsi analysé une possible interaction entre la signalisation thyroïdienne et sox2 dans la régulation de la balance prolifération/différentiation des CSN de la ZSV. Nous avons montré que chez les souris transgéniques dépourvues de toutes les isoformes de récepteur aux HT alpha (TRα1) une augmentation du nombre de cellules SOX2 positives dans la ZSV et le striatum est obervé au cours du développement. Nous avons montré par qPCR quantitative que Sox2 est réprimé par les HT dans la ZSV. Grâce à la technique de transfert de gène in vivo et à l’utilisation de gènes rapporteurs nous avons montré que les HT répriment la transcription de Sox2 au niveau des deux régions régulatrices de Sox2 : SRR1 et SRR2. Nous avons mis en évidence que le TRα1 est impliqué dans cette répression de l’expression de Sox2 : i) La vectorisation des siTRα1 entraîne une augmentation de niveau d’expression de Sox2 ; ii) Par la technique de ChIP nous avons mis en évidence l’interaction directe du TRα1 avec la région régulatrice (SRR1). Ainsi, la signalisation thyroïdienne via le récepteur TRα1 réprime l’expression d’un gène clé de l’auto-renouvellement des CSN dans la ZSV de souris adulte. Les principaux apports de ces travaux sont : i) La mise au point de la transfection de siRNA par des lipides monocationiques (INTERFERinTM) dans les cellules souches et les progéniteurs neuraux. Cet outil permet d’étudier les mécanismes régulateurs de l’expression de gènes d’intérêt dans un contexte physiologique ; et ii) Nous avons montré que les HT via TRα1 constituent un régulateur hormonal de l’expression de Sox2 dans la ZSV de souris adulte.

The discovery of adult neural stem cells has opened a wide range of perspectives for new therapies of neurodegenerative diseases. For this reason, the studies of the mechanisms that regulate the process of self-renewal, migration and differentiation of neural stem cells are very important at present. With the goal of understanding the mechanisms of gene regulation implicated in this process, the inhibition of a target gene using RNA interference technique provides a useful tool. Nevertheless one of the most important challenges is the vectorization of functional siRNA in a specific target cell population in vivo. In collaboration with the company Polyplus-Transfection, we have optimized the siRNA vectorization by the use of monocationic lipids « INTERFERinTM » in adult mouse brain. We test this tool in order to vectorise siRNA in one of the two most importants neurogenic niches into the adult mice brain: the subventricular zone. Using this approach, we were able to downregulate the expression of a key gene in neural stem and progenitor: Sox2. Sox2 expression is restricted to neural stem/progenitors cells that raise the question of how Sox2 is repressed to drive progenitor cells to the differentiation pathway. In this way, we have analyzed a possible interaction between TH and Sox2. The first indication about the participation of TH in Sox2 regulation was made in the brains of transgenic mice (TRα1). The absence of all alpha isoforms of the TH receptor (TRα) throughout development generates an increase in Sox2 positive cell number in the subventricular zone (SVZ) and in the striatum in adult mouse brain. Thus during this thesis we show by qPCR that Sox2 in the SVZ is downregulated by TH. Using in vivo gene transfer approaches, we demonstrate that Sox2 expression is downregulated at transcriptional levels by TH through their regulatory regions SRR1 and SRR2. Furthermore, we show that TRα1 is implicated in this repression: i) siTRα1 vectorisation induces Sox2 overexpression; and ii) in vivo ChIP approach shown that TRα1 interact with SRR1. In this way, thyroid hormone signaling through their TRα1 repress a key gene involve into the self-renewal of NSC in the SVZ of adult mice brain. The most important contributions of this thesis are: i) We have established the transfection protocol of siRNA by monocationic lipids (INTERFERinTM) in neural stem and progenitor cells. That allows us to study the mechanisms involved in the regulation of an interest gene in their physiological environment. Ii) We have demonstrated that TH through its receptor TRα1 represents a physiological regulator of Sox2 expression in SVZ of adult mice.