Epissage alternatif des phosphatases CDC25 dans le cancer du sein : expression des différents variants dans des modèles cellulaires et tissulaires de cancer mammaire et régulation en conditions de stress génotoxique

Alternative splicing of cdc25 phosphatases in breast cancer : expression of the different variants in cellular and tissular mammary cancer models and regulation in genotoxic stress conditions

• Auteur / Autrice : Hélène Marie Albert
• Direction : Denyse Bagrel, Eric Battaglia
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la Vie et de la Santé
• Date : Soutenance le 26/10/2011
• Etablissement(s) : Metz
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : LIMBP - Laboratoire d'Ingénierie Moléculaire et Biochimie Pharmacologique - EA 3940
• Jury : Président / Présidente : Bernard Ducommun
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mathias Montenarh

Mots clés

Mots clés contrôlés

Toxicologie génétique

Phosphatases

Cancer du sein

Mots clés libres

Phosphatases CDC25

Résumé

Les phosphatases CDC25 jouent un rôle important dans la progression du cycle cellulaire. En outre, une surexpression des CDC25 a été rapportée dans de nombreux cancers, notamment dans le cancer du sein, et est souvent corrélée à un pronostic défavorable. Les CDC25 sont constituées de trois isoformes : A, B et C codées par des gènes distincts, tous trois soumis à un mécanisme d’épissage alternatif. Quelques études ont suggéré que certains variants d’épissage de CDC25 pourraient être plus impliqués dans les cancers que d’autres, mais aucune étude de ce type n’a jusqu’à présent été menée dans le cancer du sein. Le premier aspect de cette étude, à visée clinique, consiste donc en l’évaluation de la proportion de différents variants d’épissage de CDC25 dans le cancer du sein, dans l’optique de développer un nouvel outil pronostique. Cette étude a été réalisée sur deux modèles. D’une part, différentes lignées cellulaires cancéreuses mammaires ont été caractérisées concernant l’expression des variants de CDC25 grâce à la mise au point d’une méthode de RT-PCR quantitative inédite. De manière intéressante, nous avons observé une surexpression des transcrits A2 et B2 et une augmentation du rapport C5/C1 dans les cellules résistantes aux traitements anticancéreux, laissant supposer un lien entre l’expression de ces variants et le phénotype de résistance. D’autre part, cette étude a été étendue à la détermination de l’expression des variants de CDC25 dans des tissus mammaires tumoraux par comparaison à celle des tissus péritumoraux appariés. Les résultats de PCR quantitative obtenus pour les 75 paires de tissus testées ont mis en évidence une surexpression de CDC25A dans 64% des tumeurs, principalement due au variant A1 (69%) ; de CDC25B dans 55% des tumeurs, en partie liée à l’expression des variants B1 et B2 (47% et 21% respectivement) ; et de CDC25C dans 75% des tumeurs, le variant C5 étant clairement plus impliqué que C1 (surexpression dans 86% et 43% des tumeurs respectivement). Nous avons finalement pu établir des corrélations entre l’expression des transcrits CDC25 et certaines caractéristiques anatomopathologiques des tumeurs, telles que le grade de la tumeur et un faible statut des récepteurs aux œstrogènes pour CDC25A et CDC25B et la taille de la tumeur pour CDC25C.Le second volet de ce projet consiste en une étude plus mécanistique portant sur la régulation de l’épissage des CDC25 en conditions de dommages à l’ADN. Le traitement de plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein par différents agents génotoxiques (doxorubicine, camptothécine, étoposide, cisplatine et tert-butyl hydroperoxyde) induit une modification du profil d’épissage de CDC25C, consistant en une forte augmentation de la proportion du variant C5 par rapport à celle de C1 (au niveau de l’ARNm et des protéines). Cette régulation a lieu au cours de la réponse précoce aux dommages à l’ADN, avant la mise en place de l’apoptose et est associée à un arrêt du cycle cellulaire. Nous avons par ailleurs montré que cette modulation de l’épissage de CDC25C est dépendante des kinases ATM/ATR et indépendante de p53. Ces résultats ont permis de mettre en lumière un mécanisme additionnel de réponse cellulaire à un stress génotoxique dans les cellules de cancer du sein.

CDC25 phosphatases play an important role in cell cycle progression. Moreover, an overexpression of CDC25 was reported in numerous cancers, particularly in breast cancer, and is often correlated with a poor prognosis. CDC25 are represented by three isoforms: A, B and C encoded by distinct genes, all three submitted to an alternative splicing mechanism. Few studies suggested that some CDC25 splicing variants could be more involved in cancers than others, but no such study has so far been conducted in breast cancer.The first aspect of this study, referred to clinic, consists in the evaluation of different CDC25 splicing variants proportion in breast cancer, from the perspective of developing a new prognostic tool. This study was performed on two models. On the one hand, several mammary cancerous cell lines were characterized concerning CDC25 variants expression thanks to the development of a novel quantitative RT-PCR method. Interestingly, we observed an overexpression of A2 and B2 transcripts and an increase of C5/C1 ratio in multidrug resistant cell lines, suggesting a link between the expression of these variants and the resistance phenotype. On the other hand, this study was extended to the determination of CDC25 variants expression in mammary tumoral tissues in comparison to that of matched peritumoral tissues. Quantitative PCR results obtained for the 75 pairs of tissues tested showed an overexpression of CDC25A in 64% of tumors, mainly due to A1 variant (69%); of CDC25B in 55% of tumors, partially linked to B1 and B2 variants expression (47% and 21% respectively); and of CDC25C in 75% of tumors, the C5 variant being clearly more involved than C1 (overexpression in 86% and 43% respectively). We have finally established correlations between CDC25 transcripts expression and some tumor characteristics, as the tumor grade and a lack of estrogens receptors for CDC25A and CDC25B and the tumor size for CDC25C.The second part of this project consists in a mechanistic study regarding the regulation of CDC25 splicing in DNA damage conditions. The treatment of several breast cancer cell lines with different genotoxic agents (doxorubicin, camptothecin, etoposide, cisplatin and tert-butyl hydroperoxide) induces a modification of CDC25C splicing profile, consisting in a large increase in C5 variant proportion compared to that of C1 (both at mRNA and protein levels). This regulation occurs during the early response to DNA damage, before the onset of apoptosis and is associated with a cell cycle arrest. We have also shown that this modulation of CDC25C splicing is dependent of ATM/ATR kinases and independent of p53. Finally, these results allowed to highlight an additional regulation pathway in the cellular response to genotoxic stress in breast cancer cells.