Biofonctionnalisation, caractérisation et mise en oeuvre de particules magnétiques sur biocapteurs : application au génotypage plaquettaire

• Auteur / Autrice : Marie Trévisan
• Direction : Eliane Souteyrand, Jean-Pierre Cloarec
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : STIC santé et micro et nano-technologies
• Date : Soutenance le 30/03/2011
• Etablissement(s) : Ecully, Ecole centrale de Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Électronique, électrotechnique, automatique (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : INL - Institut des Nanotechnologies de Lyon, UMR5270 (Rhône)
• Jury : Président / Présidente : Dominique Rigal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Eliane Souteyrand, Jérôme Bibette
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pierre-Yves Renard, Anny Cupo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Matériaux magnétiques

Biocapteurs

Mots clés libres

Particules magnétiques

Génotypage plaquettaire

Biocode barre

Filaments magnétiques

Biofonctionnalisation

Biocapteur à ondes évanescentes

Fluorescence

SPRI

Magnetic particles

Platelet genotyping

Bio-barcode assay

Magnetic filaments

Bio-functionnalization

Evanescent wave biosensor

Fluorescence

SPRI

Résumé

La manipulation de micro et nanoparticules magnétiques et leurs applications dans les domaines de la biologie, la biodétection et du diagnostic a continuellement gagné en intérêt ces dernières années. Ce travail de thèse explore l’utilisation des propriétés magnétiques des particules en suivant deux axes distincts.Dans un premier axe, nous avons utilisé des particules magnétiques dans une analyse par biocode barre pour la capture et la concentration de cibles biologiques. La détection a été effectuée à l’aide d’un nouveau biocapteur à onde évanescente. Le but était de pouvoir procéder à un génotypage plaquettaire sans utiliser la « Polymérase Chain Reaction » (PCR), en collaboration avec l’Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes. Nous nous sommes servis du système biallélique HPA-1 comme preuve de concept, en utilisant des cibles de type oligonucléotide synthétique pour valider nos protocoles d’analyse. Nous avons réussi à détecter une concentration de 2 fmol/l de cibles non marquées. Notre test permet de discriminer les deux allèles du gène HPA-1, qui ne diffèrent que d’un nucléotide. Notre approche par biocode barre permet d’abaisser le seuil inférieur de détection de notre biocapteur d’un facteur 125 000. Nous avons pu détecter 6.105 copies de cible synthétique, sans passer par une amplification PCR. La prochaine étape consistera à adapter le test pour analyser des échantillons biologiques réels.Dans un deuxième axe, nous avons exploré l’assemblage de particules magnétiques sous champ magnétique, de manière à fabriquer des filaments permanents ancrés sur une surface et orientables. Les filaments ont pu être greffés sur des supports homogènes de verre, d’or et sur des supports mixte verre/or fonctionnalisés de manière orthogonale. Les filaments ont pu être localisés dans des zones précises du support, soit en employant des pointes concentrant le champ magnétique localement (spots de 500 µm), soit en jouant sur la fonctionnalisation sélective sur support mixte (carrés d’or de 1 mm de côté). Typiquement l’assemblage de particules de 200 nm de diamètre a permis d’obtenir des filaments de 5 µm de longueur pour 200 à 400 nm de largeur. Les conditions de formation des filaments restent toutefois à améliorer.Les filaments magnétiques permanents ont été employés pour deux applications. Tout d’abord nous avons employé les filaments magnétiques orientables pour valider un banc d’imagerie polarimétrique par résonance de plasmon de surface (P-SPRI) développé par le LCFIO (Palaiseau). Les premières mesures tendent à montrer que l’anisotropie des filaments peut être détectée par le banc de P-SPRI, il est toutefois nécessaire de poursuivre les travaux pour mieux valider ces résultats. Deuxièmement nous avons employé des filaments magnétiques biofonctionnalisés avec des oligonucléotides sondes, pour procéder à un génotypage plaquettaire. Dans des conditions de mesure non optimisées, l’hybridation d’oligonucléotides cibles fluorescents sur les filaments ancrés sur support permet de multiplier par trois le signal de fluorescence par rapport à une hybridation sur surface plane, grâce à une augmentation de la surface spécifique du support.

Manipulation and utilization of magnetic nano/microparticles have raised some interest in the field of biology, biodetection and diagnostics during the last few years. This work explores the uses of magnetic properties of particles in two different axes.In a first part, we used magnetic particles in a bio-barcode assay for the capture and biological target concentration steps. The detection was done using a new evanescent wave biosensor. The aim was to perform a platelet genotyping without polymerase chain reaction (PCR) with the collaboration of the French national blood service (EFS). We used the biallelic system HPA-1 as proof-of-concept, using synthetic oligonucleotides as target in order to validate our protocols. The assay allows to specifically detect single nucleotide polymorphism for HPA-1 gene with a detection of 2 fmol/l of label-free target synthetic oligonucleotides. Our bio-barcode assay allows to lower the inferior limit of detection of our biosensor by a factor of 125 000. We can detect 6.105 copies of synthetic target without using a PCR amplification step. The next step will be to adapt our assay to analyze real biological samples.In a second part, we explored the assemblage of magnetic particles with a magnetic field to create permanent filaments anchored on a surface and that can be actuated. The filaments could be grafted on homogeneous glass or gold supports and also on mixed glass/gold supports with orthogonal functionalization. Filaments could be localized on precise support zones using either metallic tips concentrating locally the magnetic field (500 µm spots) or selective functionalization on mixed supports (1 mm gold squares). Assembling 200 nm diameter particles allowed to typically obtain filaments 5 µm long and 200 - 400 nm wide. The filament formation conditions could still be improved.Permanent magnetic filaments were used for two applications. Firstly, we used magnetic filaments which can be actuated to validate a polarimetric surface resonance imaging biosensor (P-SPRI) developed by the LCFIO (Palaiseau). First measurements tend to show that the anisotropy can be detected by the P-SPRI biosensor. It is necessary to continue this work to better validate the results already obtained. Secondly, we used magnetic filaments biofunctionalized by oligonucleotide probes to type platelets. In non-optimized measurement conditions, the hybridization of fluorescent target oligonucleotides on filaments anchored on a surface allows to multiply by 3 the fluorescence signal compared to hybridization on plane surface by increasing the support specific surface.